氧乙酰基对细菌多糖免疫原性的影响

　　许多细菌表面多糖，如荚膜多糖、胞外多糖、肽聚糖以及脂寡糖等都被不同程度的氧乙酰化修饰。以荚膜多糖为例，它是一种重要的毒力因子，也是细菌性多糖疫苗和结合疫苗的主要成分。有研究表明在脑膜炎球菌 A、C、Y、W135、H、I、K 以及 29E 群荚膜多糖，大肠杆菌 K1 型荚膜多糖，金黄色葡萄球菌5 型和 8 型荚膜多糖，肠道沙门菌伤寒 Vi 多糖，肺炎球菌 1、7F、9V、11A、15B、17F、18C、20、22F 和 33F型荚膜多糖，B 群链球菌 Ia、Ib、II、III、V 和 VI 型荚膜多糖中都存在不同程度的氧乙酰化修饰[1].以荚膜多糖为主要成分的疫苗，在荚膜多糖的纯化、衍生、结合过程中，氧乙酰基易受中性或碱性 pH 环境的影响而缺失，导致不同批次疫苗多糖中氧乙酰基含量存在差异。对细菌多糖中氧乙酰基特性的研究有助于理解氧乙酰化修饰对细菌功能和多糖免疫原性的影响。

　　1 细菌多糖合成机制及氧乙酰基修饰多糖机理

　　1. 1 细菌多糖合成机制 细菌荚膜多糖、胞外多糖以及脂多糖 O 抗原有着相似的合成途径，根据转运机制和糖基转移酶的差异，可以分为 3 种机制： Wzy依赖途径，合成酶依赖途径和 ABC 转运体依赖途径。其中 Wzy 和合成酶是指相应合成机制的聚合酶，这两种多糖合成机制广泛存在于革兰阴性菌和阳性菌中，而 ABC 转运体依赖途径目前只发现存在于革兰阴性菌中[2].

　　1. 1. 1 Wzy 依赖途径 这一途径主要发生在脂多糖 O 抗原的合成过程中[3].除 3 型和 37 型外，其他血清型的肺炎球菌荚膜多糖也都以此机制合成。

　　以 2 型肺炎球菌荚膜多糖为例[2],其合成途径分为三个阶段。起始阶段以胞质中糖核苷酸为供体，脂载体十一异戊烯磷酸（ Und-P） 为糖受体，糖基转移酶 Cps2E 催化反应。接下来单糖单元通过翻转酶Wzx 从细胞内膜表面翻转到外周质空间，以非渐进性聚合酶 Wzy 聚合形成长链的重复单位。最后共价链接到肽聚糖或者细胞膜表面。脂多糖 O 抗原的合成过程和上述途径类似，但是最后链接的是外膜脂质 A 的核心区域[3].

　　1. 1. 2 合成酶依赖途径 与 Wzy 途径不同，该途径最显着的特点是在多糖合成的起始阶段、聚合阶段以及转运过程中只有一种酶参与。3 型和 37 型肺炎球菌荚膜多糖[4]、透明质酸以及纤维素均由该途径合成。以 3 型肺炎球菌荚膜多糖合成为例，参与反应的合成酶是一种渐进性 β-糖基转移酶，在多糖链的延伸过程中伴随着长链转运出细胞膜。相比Wzy 途径，由该途径合成的多糖重复单位都较为简单，一般只含有一种或两种单糖，糖链最后链接的是磷脂酰甘油而不是肽聚糖。

　　1. 1. 3 ABC 转运体依赖途径 该途径主要发生在脑膜炎球菌荚膜多糖，部分型别的大肠杆菌 O 抗原的合成过程中[5].与前两种合成途径不同，在该途径中多糖链的合成是在细胞内膜胞质面完成的，通过 ABC 转运体将合成的糖链转运至细胞膜表面。

　　ABC 转运体有许多细胞学功能，包括运送营养物质、蛋白质以及多糖。其结构主要包括两对跨膜结构域 TMs 和 NBDs 以及两对辅助蛋白 KpsE 和KpsD.NBDs 结合的 ATP 水解后诱导 TMs 结构改变，从而将合成的多糖链运送至胞外。KpsE 和KpsD 促进多糖链从内膜胞质面翻转到细胞膜表面。

　　在多糖链的合成过程中，不同型别的脑膜炎球菌荚膜多糖糖基转移酶并不相同。B 群和 C 群脑膜炎球菌糖链的延伸是通过一种单一结构域的多聚唾液酸转移酶完成的，而 Y 群和 W135 群糖链的延伸是通过一种含有两个结构域的糖基转移酶完成的，分别为氨基端的己糖基转移酶和羧基端的唾液酸转移酶[6].

　　1. 2 氧乙酰基修饰多糖机理

　　1. 2. 1 细菌肽聚糖氧乙酰化的 OatA 和 PatA /PatB途径 肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，也是宿主细胞固有免疫系统中溶菌酶的主要目标。肽聚糖氧乙酰化可以保护细菌不被溶菌酶降解，从而在宿主体内诱导一系列病理生理学行为，如激活补体、发热反应等[7].其氧乙酰化位点是 N-乙酰胞壁酸残基的 C-6 羟基。氧乙酰化程度因菌种和培养条件不同而有差异，在 20% ~70%之间。

　　细菌肽聚糖氧乙酰化是细菌成熟的标志事件，两种不同的酶系统都参与了这一事件。革兰阳性菌通过一种跨膜的肽聚糖氧乙酰基转移酶（ OatA 或OatB） ,将乙酰基从胞质内乙酰辅酶 A 转移至细胞膜外肽聚糖相应的乙酰化位点上[8].在革兰阴性菌中也发现了类似的由两种蛋白构成的酶系统，跨膜的肽聚糖氧乙酰基转移酶 A （ PatA） 作为乙酰基的转运蛋白，周质的肽聚糖氧乙酰基转移酶 B（ PatB） 则负责将乙酰基从 PatA 转移至肽聚糖相应的乙酰化位点上[9].

　　1. 2. 2 脑膜炎球菌荚膜多糖乙酰基转移酶特性乙酰基转移酶可以将乙酰基从乙酰辅酶 A 转移至许多原核和真核系统的相应乙酰化底物上。不同的细菌，其乙酰基转移酶大多数分属两类蛋白质家族，一类是内在膜蛋白家族，另一类是 NodL-LacA-CysE 蛋白质家族。W135 群和 Y 群脑膜炎球菌荚膜多糖的乙酰基转移酶 OatWY 和 NodL-LacA-CysE蛋白质家族存在序列同源性，而 C 群脑膜炎球菌荚膜多糖的乙酰基转移酶 OatC 和任何已知的蛋白质之间没有序列同源性[10].

　　A 群脑膜炎球菌荚膜多糖的乙酰基转移酶 My-nC 不同于 OatWY 和 OatC,是一种新型的乙酰基转移酶。其利用乙酰辅酶 A 作为乙酰基供体，修饰荚膜多糖的氮乙酰甘露糖胺残基（ ManNAc） C-3 和 C-4的氧乙酰化，MynC 对 C 群脑膜炎球菌荚膜多糖没有作用[11].

　　1. 2. 3 wcjE 基因调控肺炎球菌荚膜多糖氧乙酰化wcjE 基因是一个高度保守的调控肺炎球菌荚膜多糖氧乙酰化的基因，目前已在 14 种血清型的肺炎球菌荚膜多糖中发现，包括 9V、11A、11D、11F、15F、20、31、33A、35A、35C、42、43、47A 和 47F 型血清型[4].wcjE 基因编码的氧乙酰基转移酶和肽聚糖、脂多糖的氧乙酰基转移酶同属于蛋白质家族PF01757[12].

　　9V 型肺炎球菌荚膜多糖有 6 个氧乙酰化位点，其中 β-N-乙酰甘露糖胺基上 C-6 和 α-糖醛酸上 C-3存在氧乙酰化修饰。研究表明，去除 wcjE 基因的9V 型肺炎球菌突变菌株，其荚膜多糖 β-N-乙酰甘露糖胺基上的 C-6 不存在氧乙酰化，说明 wcjE 基因表达的氧乙酰基转移酶在其中发挥了重要的作用[13].

　　2 氧乙酰基对细菌多糖免疫原性的影响

　　2. 1 氧乙酰基对肺炎球菌荚膜多糖免疫原性的影响 肺炎球菌是肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症等侵袭性疾病的主要致病菌。目前已发现超过 90 种的肺炎球菌血清型，荚膜多糖是其分型依据，其中 1、7F、9V、11A、15B、17F、18C、20、22F 和 33F 型肺炎球菌荚膜多糖存在氧乙酰化修饰。

　　11A 型肺炎球菌荚膜多糖平均每个重复单位上存在 2. 6 个氧乙酰基，研究表明去除氧乙酰基的11A 型肺炎球菌荚膜多糖免疫原性降低[14].去除氧乙酰基也会导致 15B 型肺炎球菌荚膜多糖抗原结构改变，诱导的功能性抗体活性损失[15].对 18C型肺炎球菌的研究表明，氧乙酰基去除的荚膜多糖，诱导的免疫原性并没有变化[16].

　　2. 2 氧乙酰基对脑膜炎球菌荚膜多糖免疫原性的影响 脑膜炎球菌是脑膜炎和脑膜炎球菌血症等侵袭性细菌感染的主要致病菌。根据荚膜多糖生物组分的不同可以分为 13 个血清型，A、B、C、W135、Y、和 X 是主要的致病血清型。其中 A 群荚膜多糖的C-3 和 C-4,C 群荚膜多糖的 C-7 和 C-8,Y 群荚膜多糖的 C-7 和 C-9 以及 W135 群荚膜多糖的 C-7 和 C-9 都存在氧乙酰化修饰[17].在英国，对脑膜炎球菌感染的携带者和临床诊断患者的研究发现，从患者体内分离出的脑膜炎球菌的荚膜多糖中 Y 群有79% 被氧乙酰化，C 群有 88% 被氧乙酰化，而 W135群只有 8%被氧乙酰化[18].

　　在小鼠中试验的研究表明，氧乙酰化修饰的 A群脑膜炎球菌结合疫苗和去氧乙酰化的结合疫苗相比，其杀菌抗体滴度增长了32 倍。抑制 ELISA 检测抗原性的结果同样表明，大多数抗体特异性识别含有氧乙酰基的荚膜多糖，表明完全去除氧乙酰基会减弱 A 群脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性和抗原性[19].但在 2010 年对一种四价脑膜炎球菌结合疫苗的三期临床试验结果表明，3 种 A 群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰化修饰程度不同 （ 68%、82%、92% ） 的结合疫苗的免疫原性没有变化，表明 A 群脑膜炎球菌荚膜多糖的氧乙酰化程度不会影响结合疫苗的免疫原性[20].

　　早在上世纪 70 年代和 80 年代，就有临床试验表明氧乙酰基对 C 群脑膜炎球菌多糖疫苗的免疫原性并非必须，并且建议在所有年龄组的接种人群中，以去除氧乙酰基的荚膜多糖替代氧乙酰化修饰的荚膜多糖作为疫苗的有效成分[21].这一观点在C 群脑膜炎球菌结合疫苗的临床前小鼠研究中得到再次确认。研究对比了由不同氧乙酰基含量的荚膜多糖和去除氧乙酰基的荚膜多糖分别制备的结合疫苗，结果表明，疫苗的免疫原性和荚膜多糖的氧乙酰基的水平具有负相关性关系，血清杀菌滴度与去除氧乙酰基荚膜多糖特异性 IgG 抗体水平相关[22].

　　随后在英国对这种去除氧乙酰基的结合疫苗进行了一系列临床研究，研究结果表明，该去除氧乙酰基的结合疫苗具有良好的耐受性，在成人、儿童、婴儿体内的免疫原性均较高。NeisVac-C 疫苗（ 百特医疗保健公司生产） 作为唯一被许可的去除氧乙酰基制备的 C 群脑膜炎球菌结合疫苗，在全世界32 个国家得到应用。

　　不同的氧乙酰化位点也会导致 C 群脑膜炎球菌荚膜多糖免疫原性的差异。有研究表明，C-7 和C-8 氧乙酰化的荚膜多糖的免疫原性并不相同。血清杀菌试验的结果表明，C-7 氧乙酰化的荚膜多糖的免疫原性要高于 C-8 氧乙酰化的荚膜多糖[1],这可能是由于 C-7 氧乙酰化的多糖和去氧乙酰化的多糖有相似的构象（ 去氧乙酰化的 C 群脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性更强，二者免疫原性相似） .

　　不同的氧乙酰化位点也会影响 Y 群脑膜炎球菌荚膜多糖的构象。C-9 氧乙酰化的 Y 群脑膜炎球菌荚膜多糖和去除氧乙酰基的荚膜多糖糖苷键链接的构象相似，而 C-7 氧乙酰化的荚膜多糖则在糖苷键链接上展现出明显的构象差异[23].有假设认为这可能是由于 C-7 氧乙酰化的荚膜多糖可能会影响唾液酸糖苷键的扭转，而 C-9 氧乙酰化的荚膜多糖氧乙酰化位点远离糖苷键，不会影响糖苷键扭转，对荚膜多糖构象没有影响。氧乙酰基对 Y 群脑膜炎球菌荚膜多糖免疫原性的影响并不明显，氧乙酰基会从 C-7 向 C-9 迁移，而 C-9 氧乙酰化的荚膜多糖和去除氧乙酰基的荚膜多糖相比，二者糖苷键链接的构象相似，因此免疫原性差别不大。

　　W135 群脑膜炎球菌荚膜多糖由半乳糖和唾液酸的二糖重复单位构成。研究表明，去除氧乙酰基对 W135 群脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性没有影响。相比氧乙酰化的荚膜多糖（ OAc+PS） ,不存在氧乙酰基的荚膜多糖（ OAc-PS） 以及用化学方法部分去除氧乙酰基的荚膜多糖（ de-OAc PS） 制备的结合疫苗有更高的多糖蛋白比，结合效率更高。在结合过程中，OAc+的荚膜多糖相比 OAc-或 de-OAc的荚膜多糖，其半乳糖残基更易受高碘酸钠活化步骤的破坏[24].

　　2. 3 氧乙酰基对伤寒 Vi 多糖免疫原性的影响 氧乙酰基构成了伤寒 Vi 多糖的部分免疫显性表位，其氧乙酰化位点是多糖骨架上 N-乙酰半乳糖胺醛酸的 C-3.Rijpkema 等[25]的研究发现，氧乙酰化程度低于 25%的伤寒 Vi 多糖疫苗，其免疫原性明显降低，表明疫苗的保护性依赖于 Vi 多糖上存在的氧乙酰基。

　　3 氧乙酰基漂移

　　20 世纪 90 年代，有研究报道[23]C 群、Y 群和W135 群脑膜炎球菌荚膜多糖在溶液中储存时会发生氧乙酰基的漂移。C 群脑膜炎球菌荚膜多糖最初溶解时，其多糖结构中 N-乙酰神经氨酸残基中 C-7和 C-8 氧乙酰化比例为 5∶ 1,多糖溶解液在 22 ℃放置数天后，这一比值为 1∶ 3.和 C 群荚膜多糖类似，Y 群和 W135 群脑膜炎球菌荚膜多糖在储存过程中也会发生氧乙酰基漂移。最初溶解的荚膜多糖和在室温下放置数天后的荚膜多糖溶解液相比，氧乙酰基从 N-乙酰神经氨酸残基中 C-7 迁移到 C-9.

　　N-乙酰神经氨酸的 C-7 和 C-9 上也存在氧乙酰基漂移[26].C-7 氧乙酰化的 N-乙酰神经氨酸溶解液在 pH 5. 0 环境下相对稳定，而在 pH 7. 5 环境下几乎全部转变为 C-9 氧乙酰化，pH 4 ~ 6 之间的环境可以避免 C-7 氧乙酰基漂移，同时可以保护氧乙酰基不被水解。在 50 mmol/L Tris/HC1 缓冲液，pH8. 0 条件下，当储存温度由 0 ℃ 上升到 37 ℃ 时，超过 70%氧乙酰基从 C-7 漂移到 C-9.

　　4 WHO 和《欧洲药典》对细菌性多糖疫苗氧乙酰基含量质控要求

　　WHO 生物制品标准化专家委员会建议 A 群脑膜炎球菌结合疫苗中荚膜多糖氧乙酰化[27],并建议使用由国家监管机构批准的已验证方法，如比色法，核磁共振氢谱法（1H NMR） ,高效阴离子交换色谱-电导测定法（ HPAEC-CD） 等来测定结合疫苗中氧乙酰基的含量。氧乙酰基的质量摩尔浓度应不低于 2mmol / g荚膜多糖（ 或每一多糖重复单位中氧乙酰基的摩尔分数≥ 61. 5%） ,以保证生产过程中批间的一致性。同时建议，如果 C 群脑膜炎球菌结合疫苗中荚膜多糖含有氧乙酰基，那么氧乙酰基的质量摩尔浓度应不低于 1. 5 mmol/g 荚膜多糖[28].专家委员会也建议对肺炎球菌结合疫苗中 1、7F、9V、11A、15B、17A、17F、18C、20、22F、33F 型荚膜多糖氧乙酰基含量进行质控，并且提出了相应型别荚膜多糖氧乙酰基含量指标[29].

　　《欧洲药典》8. 0 版也对疫苗中氧乙酰基含量提出要求[30].脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗中 A 群荚膜多糖氧乙酰基的质量摩尔浓度应不低于 2 mmol/g荚膜多糖，C 群不低于 1. 5 mmol/g 荚膜多糖，Y 群和 W135 群均不低于 0. 3 mmol/g 荚膜多糖。23 价肺炎球菌荚膜多糖疫苗中，1 型荚膜多糖氧乙酰基的摩尔分数≥1. 8% （ 每一多糖重复单位中氧乙酰基含量） ,11A 型荚膜多糖氧乙酰基的摩尔分数≥9% .伤寒 Vi 多糖疫苗中氧乙酰基的质量摩尔浓度应不低于 2 mmol/g 荚膜多糖。

　　5 结 语

　　荚膜多糖是许多病原微生物的主要毒力因子，也是细菌性多糖疫苗的主要成分。氧乙酰化修饰发生在荚膜多糖合成后，依赖于乙酰基转移酶和相应的乙酰基供体的参与。有研究报道部分型别福氏志贺菌的乙酰基转移酶基因来源于噬菌体同源性转化，但是在其他细菌中没有观察到此类现象[31].氧乙酰化修饰的绿脓杆菌黏液状胞外多糖可以帮助绿脓杆菌抵抗宿主的免疫应答[32],但细菌多糖氧乙酰化修饰的功能仍然存在争议。不同细菌多糖的氧乙酰化修饰，不同程度的氧乙酰化修饰，不同位点的氧乙酰化修饰对细菌多糖免疫原性的影响存在差异。

　　脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基漂移现象则表明氧乙酰基化学性质不稳定，细菌性多糖疫苗中对氧乙酰基含量及氧乙酰化位点的质控还有待完善。