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浅析恶性疟疾疫苗的研制

来源:学术堂 作者:韩老师
发布于:2015-11-11 共4370字

  疟疾是以疟原虫为病原体并通过按蚊叮咬传播的寄生虫病,是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一,世界上约有 20 亿人口生活在疫区[1].在我国,疟疾也是一种严重危害人类生命健康的疾病。

  2010 年我国政府公布了《中国消除疟疾行动计划(2010 ~ 2020 年)》,提出在 2020 年全国实现消除疟疾的目标[2].因此,对中国以及全球来说,迫切需要研制预防疟疾的疫苗。

  疟原虫生活史复杂,包括有性、无性两个阶段三个时期。由于疟原虫抗原在各个时期不同,抗原性较弱且有多个抗原表位,加之疟原虫的致病机理尚不十分清楚,这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。

  根据疟原虫在人体的生活史,可将疟疾疫苗分为 3 种,即抗红前期原虫疫苗、抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗。位于子孢子表面的环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)是抗红前期原虫疫苗的重要候选抗原。Dame 等[3]研究发现,在 CSP 蛋白中存在重复 37 次的 Asn-Ala-Asn-Pro(NANP)四肽重复序列(NANP repeated motif),该序列重复 4 次,而且这种重复无株间差异。Gerloni 等[4-5]构建了包含3个重复的 NANP 四肽重复序列的 IgG 重链基因的重组质粒,并用该质粒免疫小鼠后,在持续 2 年的时间内观察到机体产生了特异的抗 NANP 反应。

  Kubler-Kielb 等[6]通过蛋白质水平的偶联技术,实现了将 4 或 5 个重复的 NANP 四肽重复序列与pfs25蛋白质自身聚体的物理连接,并将此复合物免疫小鼠,结果显示,小鼠体内可产生特异性的抗 pfs25 蛋白及抗 CSP 应答。

  基于 CSP 蛋白结构,美国葛兰素史克生物公司(GSK)研发了 RTS,S / AS01 恶性疟疾疫苗,2011 年的初步研究结果显示,在为期 12 个月的观察期内,6 000 名 5 ~ 17 月龄幼儿注射 3 剂疫苗后,患疟疾和恶性疟疾的风险分别降低了 56%和 47%[7].这是恶性疟疾疫苗至今获得的最好的实验数据。

  NANP 四肽重复序列仅是 CSP 蛋白质的一个结构区域,若开发针对该四肽重复序列的单克隆抗体,则可提供检测该序列的特异性和敏感性,有益于基于 NANP 四肽重复序列的各项基础及应用研究。因此,本实验以 BSA(-NANP)5 偶联蛋白为免疫原,利用经典杂交瘤技术,筛选出 10 株杂交瘤细胞株,为进一步的研究工作奠定基础。

  1 材料与方法

  1. 1 多肽及细胞 (NANP)5 多肽、(NANP)5C 多肽均由本公司委托北京赛百盛生物公司合成,经HPLC 纯化后纯度为 95%,各合成 50 mg;SP2 / 0 骨髓瘤细胞由本公司第四研究室保存。

  1. 2 实验动物 SPF 级 BALB / c 鼠,雌性,6 ~ 8 周龄,体重 12 ~ 14 g,动物合格证号为:SYXK(甘2012-0002);清洁级 F1 鼠,雌性,体重 16 g 以上,动物合格证号为:SYXK(甘 2012-0003),均由本公司动物实验室提供。

  1. 3 主要试剂 RPMI1640、胎牛血清、黄嘌呤(hy-poxantin,HAT)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)培养基购自美国 GIBCO 公司;HRP、过碘酸钠(NaIO4)、HRP 标记的兔抗鼠 IgG、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒、己二酸二酰肼(adipicdihydrazide,ADH)、BSA、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺[1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)CarbodiimideHydrochloride,EDC]购自美国 Sigma 公司;Imject Ma-leimide Activated BSA Kit 购自美国 Thermo Scienti-fic 公司;弗氏佐剂由本公司第四研究室制备;2(-N-吗啉代)乙磺酸[2(-N-Morpholino)ethanesulfonic acidhydrat,MES]、硫氰酸氨、秋水仙素、考马斯亮蓝 R-250 等为国产试剂。

  1. 4 抗原板条 (NANP)5 及(NANP)5C 多肽、戊型肝炎病毒(HEV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、睫状神经生长因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)等抗原板条由本公司第四研究室制备并保存;CSP蛋白为中国食品药品检定研究院细菌一室惠赠[8],并由本公司第四研究室制备抗原板条。

  1. 5 完全抗原的制备 选择 BSA 作为载体蛋白,应用以下 2 种方法将(NANP)5 或(NANP)5C 多肽与载体蛋白偶联。方法 1[马来酰亚胺修饰的 BSA 与(NANP)5C偶联法:马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C 偶联,具体操作按 Imject Maleimide ActivatedBSA Kit 试剂盒说明书进行:用 1 ml 的偶联缓冲液(0. 083 mol / L sodium phosphate,0. 1 mol / L EDTA,0. 9 mol / L NaCl,0. 1 mol / L sorbitol,0. 02%叠氮钠,pH 7. 2)配制马来酰亚胺修饰的 BSA,使载体蛋白终浓度为 10 mg / ml,取 0. 5 ml 用于偶联,同时用0. 5 ml 偶联缓冲液配制(NANP)5C 多肽 25 mg,终浓度为 50 mg / ml;将多肽与载体蛋白混匀,室温孵育 180 min;以 0. 083 mol / L PBS,pH 7. 2 作为透析缓冲液透析偶联产物,过夜。方法 2[ADH-EDC介导的 BSA 与(NANP)5 偶联法]:在 0. 5 ml BSA(25 mg / ml)中加入 0. 5 ml ADH(以 0. 1 mol / LNaCl 为溶剂配制,浓度为 0. 25 mol / L),加入 0. 5 ml0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,加入 4. 5 mg EDC(浓度为 0. 05 mol / L),室温反应 6 h,期间用 0. 05 mol / LHCl 调 pH 至 5. 6;以 0. 5 mol / L NaCl,pH 7. 2 作为透析缓冲液,透析偶联产物,过夜;取 0. 5 ml 透析产物,加入 0. 5 m(lNANP)5(以 0. 2 mol / L MES 为溶剂配制,浓度为 10 mg / ml)和 0. 5 ml 0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,加入干粉 EDC(浓度为 0. 05 mol / L)室温反应 6 h,期间用 0. 05 mol / L HCl 调 pH 至 5. 6;以0. 01 mol / L PBS,pH 7. 4 作为透析缓冲液,透析偶联产物,过夜。偶联产物经 7. 5% SDS-PAGE 分析。

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