浅析恶性疟疾疫苗的研制

　　疟疾是以疟原虫为病原体并通过按蚊叮咬传播的寄生虫病，是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上约有 20 亿人口生活在疫区[1].在我国，疟疾也是一种严重危害人类生命健康的疾病。

　　2010 年我国政府公布了《中国消除疟疾行动计划（2010 ~ 2020 年）》，提出在 2020 年全国实现消除疟疾的目标[2].因此，对中国以及全球来说，迫切需要研制预防疟疾的疫苗。

　　疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加之疟原虫的致病机理尚不十分清楚，这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。

　　根据疟原虫在人体的生活史，可将疟疾疫苗分为 3 种，即抗红前期原虫疫苗、抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗。位于子孢子表面的环子孢子蛋白（circumsporozoite protein,CSP）是抗红前期原虫疫苗的重要候选抗原。Dame 等[3]研究发现，在 CSP 蛋白中存在重复 37 次的 Asn-Ala-Asn-Pro（NANP）四肽重复序列（NANP repeated motif），该序列重复 4 次，而且这种重复无株间差异。Gerloni 等[4-5]构建了包含3个重复的 NANP 四肽重复序列的 IgG 重链基因的重组质粒，并用该质粒免疫小鼠后，在持续 2 年的时间内观察到机体产生了特异的抗 NANP 反应。

　　Kubler-Kielb 等[6]通过蛋白质水平的偶联技术，实现了将 4 或 5 个重复的 NANP 四肽重复序列与pfs25蛋白质自身聚体的物理连接，并将此复合物免疫小鼠，结果显示，小鼠体内可产生特异性的抗 pfs25 蛋白及抗 CSP 应答。

　　基于 CSP 蛋白结构，美国葛兰素史克生物公司（GSK）研发了 RTS,S / AS01 恶性疟疾疫苗，2011 年的初步研究结果显示，在为期 12 个月的观察期内，6 000 名 5 ~ 17 月龄幼儿注射 3 剂疫苗后，患疟疾和恶性疟疾的风险分别降低了 56%和 47%[7].这是恶性疟疾疫苗至今获得的最好的实验数据。

　　NANP 四肽重复序列仅是 CSP 蛋白质的一个结构区域，若开发针对该四肽重复序列的单克隆抗体，则可提供检测该序列的特异性和敏感性，有益于基于 NANP 四肽重复序列的各项基础及应用研究。因此，本实验以 BSA（-NANP）5 偶联蛋白为免疫原，利用经典杂交瘤技术，筛选出 10 株杂交瘤细胞株，为进一步的研究工作奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1. 1 多肽及细胞 （NANP）5 多肽、（NANP）5C 多肽均由本公司委托北京赛百盛生物公司合成，经HPLC 纯化后纯度为 95%,各合成 50 mg;SP2 / 0 骨髓瘤细胞由本公司第四研究室保存。

　　1. 2 实验动物 SPF 级 BALB / c 鼠，雌性，6 ~ 8 周龄，体重 12 ~ 14 g,动物合格证号为：SYXK（甘2012-0002）；清洁级 F1 鼠，雌性，体重 16 g 以上，动物合格证号为：SYXK（甘 2012-0003），均由本公司动物实验室提供。

　　1. 3 主要试剂 RPMI1640、胎牛血清、黄嘌呤（hy-poxantin,HAT）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）培养基购自美国 GIBCO 公司；HRP、过碘酸钠（NaIO4）、HRP 标记的兔抗鼠 IgG、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒、己二酸二酰肼（adipicdihydrazide,ADH）、BSA、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺[1-Ethyl-3-（3-Dimethylaminopropyl）CarbodiimideHydrochloride,EDC]购自美国 Sigma 公司；Imject Ma-leimide Activated BSA Kit 购自美国 Thermo Scienti-fic 公司；弗氏佐剂由本公司第四研究室制备；2（-N-吗啉代）乙磺酸[2（-N-Morpholino）ethanesulfonic acidhydrat,MES]、硫氰酸氨、秋水仙素、考马斯亮蓝 R-250 等为国产试剂。

　　1. 4 抗原板条 （NANP）5 及（NANP）5C 多肽、戊型肝炎病毒（HEV）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、睫状神经生长因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF）等抗原板条由本公司第四研究室制备并保存；CSP蛋白为中国食品药品检定研究院细菌一室惠赠[8],并由本公司第四研究室制备抗原板条。

　　1. 5 完全抗原的制备 选择 BSA 作为载体蛋白，应用以下 2 种方法将（NANP）5 或（NANP）5C 多肽与载体蛋白偶联。方法 1[马来酰亚胺修饰的 BSA 与（NANP）5C偶联法：马来酰亚胺修饰的BSA与（NANP）5C 偶联，具体操作按 Imject Maleimide ActivatedBSA Kit 试剂盒说明书进行：用 1 ml 的偶联缓冲液（0. 083 mol / L sodium phosphate,0. 1 mol / L EDTA,0. 9 mol / L NaCl,0. 1 mol / L sorbitol,0. 02%叠氮钠，pH 7. 2）配制马来酰亚胺修饰的 BSA,使载体蛋白终浓度为 10 mg / ml,取 0. 5 ml 用于偶联，同时用0. 5 ml 偶联缓冲液配制（NANP）5C 多肽 25 mg,终浓度为 50 mg / ml;将多肽与载体蛋白混匀，室温孵育 180 min;以 0. 083 mol / L PBS,pH 7. 2 作为透析缓冲液透析偶联产物，过夜。方法 2[ADH-EDC介导的 BSA 与（NANP）5 偶联法]:在 0. 5 ml BSA（25 mg / ml）中加入 0. 5 ml ADH（以 0. 1 mol / LNaCl 为溶剂配制，浓度为 0. 25 mol / L），加入 0. 5 ml0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,加入 4. 5 mg EDC（浓度为 0. 05 mol / L），室温反应 6 h,期间用 0. 05 mol / LHCl 调 pH 至 5. 6;以 0. 5 mol / L NaCl,pH 7. 2 作为透析缓冲液，透析偶联产物，过夜；取 0. 5 ml 透析产物，加入 0. 5 m（lNANP）5（以 0. 2 mol / L MES 为溶剂配制，浓度为 10 mg / ml）和 0. 5 ml 0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,加入干粉 EDC（浓度为 0. 05 mol / L）室温反应 6 h,期间用 0. 05 mol / L HCl 调 pH 至 5. 6;以0. 01 mol / L PBS,pH 7. 4 作为透析缓冲液，透析偶联产物，过夜。偶联产物经 7. 5% SDS-PAGE 分析。