免疫学论文
食物过敏是世界范围内常见的变态反应，近年来发病率不断上升[1].食物过敏是由 IgE 介导的Ⅰ型过敏反应，可引起腹泻、呕吐、水肿、皮炎、哮喘等临床症状，严重可引起休克，甚至危及生命。流行病学研究表明： 发达国家的成人食物过敏性疾病的患病率已高达 3%,儿童为 6%[2].其中，甲壳类食物作为粮食农业组织（ Food and Agriculture Organiza-tion,FAO） / 世界卫生组织 （ World Health Organiza-tion,WHO） 认定的 8 大过敏食物之一，被认为是引起食物过敏的常见原因[3].与大多数的食物过敏不同，甲壳类食物通常引起的食物过敏是终生的，而且现在对于甲壳类食物过敏的治疗，主要依靠于特异性免疫治疗（ SpecificImmunotherapy,SIT） ,所以对甲壳类食物过敏组分的确定极其重要[4].甲壳类食物中含有多种蛋白质，过敏原组分十分复杂[5].其中，原肌球蛋白（ Tropomyosin,TM） 是最早被发现的甲壳类动物过敏原[6,7].近年来，精氨酸激酶、肌球蛋白轻链和肌质钙结合蛋白也相继被鉴定为甲壳类食物的主要过敏原[8-10].蟹是甲壳类食物的重要组成，种类繁多。
中华绒螯蟹（ Eriocheir sinensis） 原产于中国，是中国特别是长江流域最经济、最重要的淡水水生物种之一。在 2005 年，中国中华绒螯蟹的产量已经达到了4. 0×105t[11],而且在过去的十年中，随着蟹文化的发展，中华绒螯蟹越来越受到人们的喜爱。因此，由中华绒螯蟹引起的食物过敏在我国较为常见。现已报道的中华绒螯蟹的主要过敏原只有原肌球蛋白和精氨酸激酶[12],对其他的过敏原组分未见报道[13].
我们先前对梭子蟹过敏原的分析中，发现除了已明确的 36 kD、40 kD 的原肌球蛋白、精氨酸激酶外，高分子量的蛋白也占有很大比例。其中，70 kD和 74 kD 的蛋白百分比最高，且与过敏患者血清反应，显示多条反应条带，且颜色较深[14].由此，本文探究在中华绒螯蟹中，高分子量蛋白是否也是重要的过敏原，并进一步丰富人类对中华绒螯蟹过敏组分的认识。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 仪器 垂直板型电泳仪、电转印槽、二维电泳仪、凝胶成像系统（ 美国 Bio-Rad 公司） ; 低温高速冷冻离心机 （ Beckman 公司） ; 凝胶成像系统 （ChampGel 公司） .
1. 1. 2 试剂 硫脲、碘乙酰胺、载体两性电解质IPG-buffer、pH 为 3 ~ 10 的干胶条购自于美国 GE 公司； 血蓝蛋白、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠（ SDS） 、四甲基乙二胺（ TEMED） 、吐温-20（ Tween-20） 均购自美国 Sigma公司； 蛋白分子质量标准 SM0671（ 加拿大 Fermentas公司） ; 聚偏二氟乙烯（ PVDF） （ 美国 Millipore 公司） ; 鼠抗人 IgE-AP 抗体、鼠抗人 IgE-HRP 抗体（ 美国 Jackson Immunoresearch 公司） .
1. 2 方法
1. 2. 1 血清标本 随机选取天津市长征医院的蟹过敏患者 23 例，男 14 例，女 9 例，阳性血清纳入标准为患者有典型过敏史，临床确诊为蟹类过敏，血清总 IgE>100 kU/L,血清蟹 sIgE>0. 35 kU/L 等。阴性对照血清来自健康体检人群，纳入标准为无过敏家族史，无食物过敏史，血清总 IgE<100 kU/L.采集研究对象静脉血，分离血清并分装，-20 ℃ 保存备用。
1. 2. 2 蟹总蛋白的提取 中华绒螯蟹购买自天津市三义庄菜市场，现杀去壳、取肌肉组织。取 5 g 新鲜中华绒螯蟹肌肉组织，剪碎，在液氮中充分研磨至粉末状，用匀浆器匀浆，加入 5 ml 裂解液[7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4% （ w/v） CHAPS,65 mmol/LDTT,40 mmol / L Tris],震荡混匀后，于冰上静置 30min,使蛋白质充分溶解到裂解液中。使用低温高速冷冻离心机于4℃下12 000 r/min 离心30 min,取上清液即为蟹总蛋白粗提液。分装，-80℃保存备用。