人体生理学论文

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确定NTS内参与心脏伤害性感受的谷氨酸受体亚型

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2014-07-17 共7874字
论文摘要

  位于延髓的孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)在心血管、呼吸以及胃肠道的初级感觉信息的整合和传递中扮演重要的角色。心脏伤害性感受信息主要由伴随心交感神经和心迷走神经的传入纤维传递,经不同的传入通路上传到中枢引起相应的反应。解剖学研究表明:
  NTS既是心迷走神经传入的中枢投射部位,同时也是心交感神经的中转部位。NTS在伤害性信息的传递中扮演不同的角色,既有抑制作用也有易化作用,但NTS对心脏伤害性感觉信息的作用到目前为止尚不清楚。
  谷氨酸是NTS内主要的兴奋性神经递质,谷氨酸受体分为2大类:一类为离子型受体,包括N-甲基-D-天 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartic  acid,NMDA)型、α-氨 基-3-羟 基-5-甲 基-4-恶 唑-丙 酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionicacid,AMPA)型和海人藻酸(kainic acid,KA)型,后2种也统称为非NMDA受体,其与离子通道偶联,形成受体-通道复合物,介导快信号或快突触传递;另一类为促代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors,mGluRs),其与膜内的G-蛋白偶联,被激活后通过G-蛋白效应器酶、胞内第二信使等组成的信号转导系统起作用,产生包括慢突触传递等较缓慢的生理反应。
  NMDA受 体 和mGluRs参与痛觉过敏, 但NTS内谷氨酸及其受体亚型在心脏伤害感受中的作用尚不清楚。辣椒素是伤害性感受神经元的选择性激活物质,可以选择性地作用于有伤害性感受作用的C和Aδ神经纤维末梢。研究表明:心脏表面给予辣椒素可以激活伴随迷走和交感神经的传入纤维,心包内注射辣椒素可以诱发心脏-躯体运动反射 (cardiosomatic motor reflex,CMR),背斜方肌肌电(electromyogram,EMG)活动明显增强。本研究利用心包内注射辣椒素诱发的CMR为心脏伤害性感受指标,于NTS内分别微量注射谷氨酸及各受体亚型拮抗剂观察其对CMR的影响,确定NTS内参与心脏伤害性感受的谷氨酸受体亚型,旨在为NTS内参与心脏伤害性感受信息调控的神经递质和受体提供新的证据。

  1材料与方法

  1.1 主要试剂和仪器 辣椒素溶于吐温80和无水乙醇(按1∶1比 例 混 合)溶 液 中,配 制 成1×10g·mL-1的贮存液,实验时用生理盐水稀释到所需浓度1mg·L-1。鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid,IBO)、谷氨酸、NMDA受体拮抗剂[(+)-MK-801hydrogen maleate,MK-801]、非NMDA受 体 拮抗 剂6,7-二 硝 基 喹 喔 啉-2,3二 酮 (6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione,DNQX)均 用 生 理盐水溶解。
  mGluRs拮抗剂α-甲基,4-羧基苯丙氨酸 [(RS)-a-methyl-4-carboxyphenylglycine,MCPG]先用NaOH(1mol·L-1)溶解后,再用生理盐水稀释,所有药物最终的pH值调整为7.2~7.6,所用药物均购自美国Sigma公司。
  BL-420生物信号采集与分析系统(成都泰盟生物科技有限公司),压力换能器(成都泰盟生物科技有限公司),蠕动泵(BT100-2J,保定兰格恒流泵有限责任公司),小动物呼吸机(DW3000-B型,淮北正华生物仪器设备有 限公司),大鼠脑立 体 定 位 仪 (日 本Narishige公司),Olympus生物显微镜(BX51,日本Olympus公 司 ),0.5μL微 量 注 射 器(Hamilton,Reno,Nevada,USA)。
  1.2 实验动物、动物分组及处理方法 健康雄性SD大鼠60只,体质量260~330g,将其随机分为IBO组、 谷 氨 酸 组、MK-801组、MCPG组、MCPG联合MK-801组和DNQX组;各组大鼠孤束核内分别微量注射130mmol·L-1IBO 100nL,10.0、20.0、50.0 mmol·L-1谷 氨 酸100 nL,NMDA受体拮抗剂40和60mmol·L-1MK-801100 nL,代谢型谷氨酸受体拮抗剂25和50mmol·L-1MCPG 100 nL,25 mmol·L-1MCPG 50nL联合40mmol·L-1MK-80150nL,非NMDA受体拮抗剂20和50mmol·L-1DNQX100nL。
  1.3 大鼠心包插管术和 NTS内微量注射手术大鼠称质量后以初始剂量的戊巴比妥钠 (45~55mg·kg-1)静脉滴注麻醉。取俯卧位,暴露左侧背斜方肌,以记录背斜方肌EMG。再取仰卧位,行气管插管术,右侧颈动脉插管监测动脉血压,左侧颈静脉插管以便在整个实验过程中维持戊巴比妥钠的麻醉(10~15mg·kg-1·h-1)。以动脉血压和瞳孔直径监测实验动物麻醉深度。①心包插管术:左侧上胸部第1到第3肋软骨处行开胸术,暴露胸腺。中线处分离胸腺,暴露心包膜。玻璃分针尖端(直径0.5mm)在心包膜上扎开1个小孔,将一长12~14cm远端有数个小洞的硅胶管(内径0.020mm、外径0.037 mm)经 此 孔 插 入 心 包 约2cm,缝合胸腺和各层胸壁组织,以固定心包插管。② NTS内微量注射:将大鼠固定于脑立体定位仪上,剪开枕骨处头皮,钝性分离附着于枕骨处的肌肉,暴露枕骨。微型电钻钻透枕骨后,用咬骨钳剥离部分颅骨,在闩部水平去除硬脑膜和软脑膜。实验中药物注射位点以写翮(第4脑室尾侧最后点)为零坐标(相当于前囟后14.3mm水平),左侧旁开0.5~0.8mm,吻侧0~0.5mm,脑表面下0.5~0.8mm。微量注射使用尖端与玻璃微电极相连的0.5μL微量注射器,微电极尖端直径为50~100μm。NTS内微量注射量为0.1μL,速度为0.1μL·s-1。根据以往研究以及预实验选择药物的剂量。
  1.4 CMR记录过程同芯电极以30°的角度插入左侧背斜方肌,记录其EMG信号,根据肌肉大小调节电极插入深度,插入深度一般为1.5~1.7mm。手术完毕2~3h,待动物状态稳定后记录EMG基线活动60s,NTS内微量注射生理盐水100 nL,15 min后心包腔内注射辣椒素(0.655nmol/0.2mL)1 min后 回 抽 并 冲 洗 心 包4~6次,同 时 记 录EMG 60~65s。50 min后NTS内注射谷氨酸或者谷氨酸受体不同的拮抗剂100nL,15min后心包腔内注射辣椒素1min后回抽并冲洗心包,同时记录EMG 60~65s,观察药物对EMG活动的影响。间隔1h后心包腔内注射辣椒素0.2mL,观察EMG恢复情况。
  EMG以反应中的放电单位总数计算,以NTS内注射生理盐水后的EMG反应为对照,将其定义为100%。计算注射药物后的EMG与生理盐水比较的百分比。
  EMG以反应中的放电单位总数计算,以NTS内注射生理盐水后的EMG反应为对照,将其定义为100%;计算注射药物后EMG变化的百分比。实验结束后,NTS微量注射位点原位微注射2%膀胺天蓝100nL,以标记药物注射位点及扩散范围。
  10 min后 静 脉 内 注 入 过 量 戊 巴 比 妥 钠(100mg·kg-1)深麻大鼠,经左心室插管至升主动脉,先用50mL生理盐水快速灌注冲洗血液,再用约200mL 10%甲醛溶液灌流固定。灌流结束后取脑组织,放置于10%的甲醛固定液中室温固定4h,再转移到20%的蔗糖溶液中4℃沉糖48h。待组织沉糖完全后进行冰冻切片,片厚30μm,行尼氏染色,显微镜下根据大鼠脑图谱进一步确定注射位点(图1)。
NTS内微量注射位点图
  1.5统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件对数据进行分析处理。EMG变化的百分比以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素重复测量方差分析。
 
  2结果

  2.1 NTS内微量注射IBO 后 CMR的变化 NTS联合部微量注射130mmol·L-1IBO 100nL,1和2h后EMG放电总数分别为 (56.4±6.9)%和(40.5±5.4)%,与 对 照 组 比 较 明 显 下 降 (P<0.01)。见图2。
  NTS内注射IBO后CMR的肌电图
  2.2 NTS 内微量注射谷氨酸后 CMR 的变化 NTS内分别微量注射100、200和500mmol·L-1谷氨酸后,EMG活动分别为 (116.9±4.9)%、(143.9±10.2)%和 (214.2±15.8)%,与生理盐水对照组比较CMR均增加 (P<0.05)。见图3。

  2.3 NTS内微量注射谷氨酸受体亚型拮抗剂后 CMR 的 变 化   NTS内 微 量 注 射40和60mmol·L-1MK-801 100nL后,EMG活动分别为 (45.2±10.6)%和 (36.8±14.3)%,与生理盐水对照组比较明显下降 (P<0.05)。NTS内微量注射25和50mmol·L-1MCPG后,EMG活动分别为 (65.2±16.3)%和 (57.0±4.2)%,与生理盐水对照组比较明显下降 (P<0.05)。NTS内联合微量注射25mmol·L-1MCPG和80mmol·L-1MK-801后,EMG活动为 (22.5±13.2)%,与单独注射MCPG或者MK-801后比较EMG活动明显下 降 (P <0.05)。NTS内 微 量 注 射20和50mmol·L-1DNQX后,EMG反应为 (99.6±18.6)%和 (104±12.4)%,与生理盐水对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。见图3。
  NTS内注射谷氨酸和谷氨酸受体拮抗剂后CMR的肌电图
  3讨论

  以往研究表明:心脏感觉传入神经纤维至少通过2条通路上传到中枢神经系统,即伴随心交感神经的传入纤维和伴随心迷走神经的传入纤维。大部分迷走传入神经纤维直接投射到位于延髓的NTS。束路追踪研究表明:心脏交感传入神经纤维通过星状神经节和交感神经链投射到上胸段脊髓背角,而来自脊髓颈部和胸部背角的投射纤维中枢部同样也会终止于NTS。Albutaihi等研究表明:心包内注射化学致痛剂可以诱发c-Fos在NTS内的表达。这些结果提示NTS是心脏伤害性感觉信息传递的重要驿站。在本实验中NTS联合部微量注射选择性的神经元胞体损毁剂IBO,抑制了心包腔内注射辣椒素诱发的EMG反应;NTS联合部内微量注射兴奋性神经递质谷氨酸以选择性地激活神经元胞体,结果显示谷氨酸对心包内注射辣椒素诱发的CMR有明显的易化作用,且呈剂量依赖性的增加关系。这2项结果提示:
  NTS在心脏伤害性感觉信息的中枢调控过程中起易化作用,且这种易化作用是以谷氨酸作为其兴奋性神经递质的。该结果与以往的研究结果一致,解剖学以及电生理学实验研究证明:谷氨酸是NTS内重要的兴奋性神经递质,激活NTS内神经元可以对伤害性感受产生易化调控作用。由于NTS同时是心脏伤害性感受的初级传入中枢,对于这种易化作用的产生有2种可能:一种是谷氨酸激活了NTS参与的伤害性信息的内源性下行易化调控通路;另外可能是因谷氨酸是 心脏 伤害性感受 初 级 传 入 纤 维 在NTS内的神经递质,注射谷氨酸增加了初级传入信息从而产生易化效应。对于这2种可能性还需进一步的研究证实。
  免疫细胞研究以及分子生物学研究证实:
  NMDA受体、非NMDA受体以及代谢型谷氨酸受体亚型在NTS内均有表达。不同的谷氨酸受体亚型在伤害性感受的作用有所不同。研究表明:
  NTS内的NMDA受体介导胃内注射盐酸诱发的胃痛觉感受;mGluRs对炎症诱发的脊髓超兴奋的产生是必须的,并且mGluR参与痛觉过敏的行为学反应的形成。但是,NTS内谷氨酸各受体亚型在心脏伤害性感觉信息的调控中的作用尚未见报道。
  为了进一步明确不同的谷氨酸受体亚型在心脏伤害性感受中的作用,本研究观察不同受体亚型拮抗剂对心包内注射辣椒素诱发的CMR的影响,结果显示:微量注射NMDA受体拮抗剂MK-801对CMR有明显的抑制作用,提示NTS内的NMDA受体参与心脏伤害性感受的易化调控作用。该结果与以往研究结果一致。以往研究已经明确表明:脑干NMDA受体在痛觉的下行易化调节通路中有重要的作用。
  NMDA受体拮抗剂AP-V直接注射到延髓头端腹内侧部 (RVM)阻止了结肠炎症和芥子油诱发的内脏痛觉过敏。但是,本研究中非NMDA受体拮抗剂DNQX对CMR无明显的影响,说明NTS内非NMDA受体未参与NTS对心脏伤害性信息的易化调控作用。
  mGluRs是与G蛋白偶联的受体家族。研究显示:脊髓mGluRs对炎症诱发的脊髓超兴奋的产生有重要的意义;同时mGluRs的激活参与痛觉过敏的行为学反应的产生,提示mGluRs在痛觉的下行易化调节中有重要的作用。本研究中NTS内微量注射mGluRs拮抗剂MCPG使心包腔内注射辣椒素诱发的肌肉痛觉过敏降低,提示NTS内的mGluR参与心脏伤害性感受的易化调控。但是,不同的mGluRs亚型在心脏伤害性感受调控中的作用还需进一步的研究证实。

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