骨形成中巨噬细胞的作用综述

　　摘    要：　巨噬细胞在骨形成中发挥关键作用，其具体的表现由多个复杂的生物学机制共同调控，巨噬细胞分泌的某些信号分子如抑瘤素M(OSM)、前列腺素E2(PGE2)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等在成骨过程中具有关键作用。另外，巨噬细胞的极化亚型也在成骨过程中发挥调控作用。本文对近年来巨噬细胞影响骨形成的相关机制研究进展进行综述。

　　关键词 :     巨噬细胞;骨形成;间充质干细胞;

　　Abstract：　Macrophages play a key role in bone formation, and their specific performance is regulated by multiple complex biological mechanisms. Specifically, certain signaling molecules secreted by macrophages, such as oncostatin M(OSM), prostaglandin E2(PGE2), bone morphogenetic protein-2(BMP-2), and tumor necrosis factor-α(TNF-α), have a key role in osteogenesis. In addition, polarized subtypes of macrophages also play a regulatory role at different stages of osteogenesis. This article reviews the research progress of the related mechanisms of macrophages influencing bone formation in recent years.

　　Keyword：　macrophages; osteogenesis; mesenchymal stem cells;

　　巨噬细胞由单核细胞分化而来[1],是免疫系统中重要组成部分，在宿主防御和调控炎症反应中发挥着关键作用。在急性炎症过程中，巨噬细胞可吞噬入侵的异物促进组织稳态的恢复，随着组织损伤的清除，巨噬细胞会通过募集祖细胞、分泌抗炎因子及生长因子来促进细胞的分化、血管再生并最终完成组织修复[2]。

　　骨巨噬细胞是一类广泛分布于骨内膜和骨外膜组织的巨噬细胞群，约占骨髓所有细胞的1/6[3]。越来越多的骨免疫学证据显示，骨巨噬细胞在骨形成过程中具有关键的调控作用，本文将对这一作用以及包含的相关分子机制进行综述。

　　1 、巨噬细胞是促进成骨的关键因素

　　巨噬细胞作为骨稳态的重要调节者，是促进成骨的关键因素。2018年He等[4]研究结果表明，RAW 264.7细胞系的条件培养基(conditioned media, CM)会促进骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell, BMSC)的增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ,ALP)的活性，说明巨噬细胞有利于促进BMSC的成骨向分化。2013年Pirraco等[5]将巨噬细胞和人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cell, hBMSC)共培养，发现hBMSC的增殖、ALP活性以及骨钙蛋白(osteocalcin, OCN)和骨桥蛋白(osteopontin, OPN)的表达水平都升高，进一步证明了巨噬细胞能有效诱导hBMSC成骨向分化。另外，2015年Vi等[6]敲除小鼠的巨噬细胞后，观察到早期骨骼生长迟缓和进行性骨质疏松症，同时，骨髓间充质祖细胞数量且成骨向分化能力降低； 2018年Schlundt等[7]观察到，通过氯膦酸盐脂质体处理使巨噬细胞耗竭，会导致骨折愈合延迟。以上研究有力地证实了巨噬细胞通过调控间充质干细胞成骨向分化能力来促进骨形成。

　　2 、巨噬细胞可调控成骨相关细胞因子的表达

　　2.1、 抑瘤素M(oncostain M,OSM)

　　OSM是IL-6家族中的一类细胞因子，可由单核细胞和巨噬细胞产生，在促进成骨分化中发挥重要作用。

　　2012年Guihard等[8]研究表明，巨噬细胞产生的OSM可以与间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)中的OSM受体(OSMR)结合，激活信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3, STAT3)-CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein delta)-C / EBPδ-核结合因子α1(core binding factor alpha 1,Cbfa1)分化途径，从而诱导MSC成骨向分化和基质矿化。2015年Guihard等[9]利用胫骨损伤的小鼠模型的体内实验进一步证明巨噬细胞的产物OSM通过OSMR和STAT3信号传导，促进间充质祖细胞的成骨分化。另外，Ni等[10]的研究结果显示OSM可能通过抑制Notch配体、受体和靶基因的表达，来促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的分化。进一步研究证实，OSM的浓度也会影响最后的成骨效果。浓度为5 ng/mL的OSM对MC3T3-E1中ALP表达无明显作用，但当OSM的浓度超过10 ng/mL后， ALP活性增加，且在50 ng/mL的剂量可观察到最明显的作用(峰值)。综上所述，巨噬细胞可通过分泌OSM促进骨形成，且STAT3途径的激活在此过程中具有重要意义。

　　2.2 、PGE2

　　前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是一种重要的骨代谢调节剂，是前列腺素(PG)的一种，与OSM类似，PGE2在骨内也可由巨噬细胞产生。

　　2012年Guihard[8]等实验证明，在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活巨噬细胞的Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)后，环氧酶2(cyclo-oxygen-ase2, COX2)表达升高，从而增加PGE2分泌。2017年Lu等[11]研究表明，MSC与巨噬细胞共培养4周后可以调控成骨早期的PGE2分泌从而增强骨矿化作用。2011年Ninomiya等[12]将PGE2受体的一种亚型EP4受体(eprostanoid receptor 4)选择性激动剂ONO-4819注入大鼠中，显着增加了骨形成，说明PGE2主要通过EP4受体介导在骨形成中发挥调节作用。同样，Pilbeam等[13]指出，给予PGE2或EP2和EP4激动剂，都可以加速骨骼修复。

　　PGE2除了可以直接促进成骨向分化以外，也可通过诱导巨噬细胞中OSM及骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)的产生[8,14,15],从而间接促进骨形成。由于MSC和巨噬细胞都可以分泌PGE2并调节COX2活性，故MSC和PGE2之间存在一种动态的相互作用，可能通过自分泌和旁分泌信号传导两种方式来增强成骨作用[11]。故PGE2在巨噬细胞促进成骨以及巨噬细胞与MSC的相互作用中具有重要作用。

　　2.3、 BMP-2

　　BMP-2可由巨噬细胞及MSC产生，已被确定在诱导成骨中起着核心作用。

　　2013年Pirraco等[5]将巨噬细胞与hBMSC共培养，发现hBMSC的增殖率及ALP表达都升高，且向培养物中添加抗BMP-2抗体后，该作用被抑制。2014年Chen等[16]研究表明，小鼠巨噬细胞和β-TCP共培养产物可显着增强BMSC的成骨向分化，且BMP-2信号通路相关基因的表达明显上调，进一步证明BMP-2发挥了关键作用。2012年Haversath等[17]指出：巨噬细胞释放的BMP-2会激活成骨细胞内信号分子SMAD (mothers against decapentaplegic homologue),并进一步促进Dlx5和Runx相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达，从而增强BMSC的成骨分化。

　　此外，巨噬细胞还可以诱导MSC产生自体BMP-2。 2011年Omar等[18]研究表明，巨噬细胞的CM会导致hMSCs中BMP-2表达的升高，从而促进MSCs的成骨分化。2017年Zhang等[19]研究表明，M2型巨噬细胞可促进MSCs内源性BMP-2的分泌。综上所述，巨噬细胞可通过直接分泌BMP-2或者通过外泌体诱导MSC产生自体BMP-2两种途径来促进骨形成。

　　2.4、 TNF-α

　　肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种促炎因子，主要由巨噬细胞分泌，是骨重塑过程中的重要调节因子。

　　2010年Cho等[20]用TNF-α处理脂肪间充质干细胞(adipose derived mesen-chymal stromal cell, ADSC),发现TNF-α通过活化核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)和具有PDZ结合序列的转录共活化因子(transcriptional coactivator with PDZ- binding motif, TAZ)后续表达增强成骨作用。2013年Briolay等[21]指出，在MSC中，TNF-α显着增加Wnt5a的水平，从而促进成骨，当Wnt5a被阻断时，成骨细胞的矿化作用减弱。

　　但是，与上述研究结果相反，有研究证实TNF-α对成骨分化有一定的抑制作用。2011年Zhao等[22]研究指出，TNF使小鼠细胞中E3泛素蛋白连接酶1(WW Proteinligase1,Wwp1)表达显着增加，Wwp1促进JunB的泛素化和降解，从而抑制MSC成骨分化。同时，TNF-α还通过促进Notch信号的表达抑制MSC成骨向分化[23]。2011年Huang等[24]的研究结果表明，TNF-α在较低浓度时主要激活有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)家族成员，从而对成骨分化产生积极影响。而在较高浓度时导致NF-κB信号通路的激活，从而抑制成骨。而长时间的任意浓度TNF-α处理都会抑制成骨。综上，巨噬细胞可通过产生TNF-α来影响骨形成，且这种调控作用因TNF-α浓度[25]的高低而显示不同的结果。

　　3 、巨噬细胞极化亚型在骨形成中发挥关键作用

　　在不同的环境刺激下，巨噬细胞可向不同亚型极化[3]:促炎型巨噬细胞M1型(经典活化的巨噬细胞)和抗炎型巨噬细胞M2型(替代性活化的巨噬细胞)。不同亚型的巨噬细胞在成骨分化的不同阶段发挥不同的作用。

　　2011年Omar等[18]研究表明：M1型巨噬细胞的CM可促进hMSC中Runx2和ALP基因表达上调，而M2型巨噬细胞未产生明显影响。2012年Guihard等[8]实验证明通过LPS激活TLR后，M1型巨噬细胞可产生OSM,从而促进成骨。然而，有其他实验得出了相反的结论。2017年Zhang等[19]实验表明， 与M2型巨噬细胞共培养后，ADMSC矿化作用明显增强，而在与M1型或M0型巨噬细胞共培养中未发现相同的结果。2016 年Gong等[26]将不同亚型巨噬细胞与MSC共培养，研究结果显示MSC中成骨向分化相关基因的表达在与M2型巨噬细胞共培养后上调，而与M1型巨噬细胞共培养后相关基因表达下降。上述实验结果的差异可能与实验设计有关，如使用巨噬细胞条件培养基来培养MSC或将巨噬细胞与MSC共培养可能得出不同的结论，另外，MSC有诱导巨噬细胞从M1型向M2型转化的趋势[2],故在共培养过程中也可能发生巨噬细胞亚型的波动[19]。除此之外，还有其他因素也可能在一定程度上影响结果，如干细胞的来源(骨髓或者脂肪组织),共培养的时长，以及巨噬细胞与干细胞的比例等。

　　最后，不同亚型的巨噬细胞可能在不同的阶段发挥作用。2018年Zheng[27]等实验指出，M1型巨噬细胞促进了间充质干细胞迁移，而M2型巨噬细胞显着增强了细胞增殖和成骨向分化。2017年Lu等[11]实验结果证明，早期将MSCs暴露于高密度的促炎型M1型巨噬细胞中，可使MSC分泌更高水平的PGE2和其他抗炎信号，从而增强成骨分化，说明短暂的早期炎症阶段对成骨至关重要。同时，2016年Loi等[28]实验结果指出，在共培养72 h后，通过IL-4处理巨噬细胞将其调节为M2表型，可进一步增强成骨作用。2020年Guo等[29]研究发现固有骨诱导材料上培养的巨噬细胞在培养4 d后更易向M2型巨噬细胞极化，说明在适当的时候促进M1向M2极能形成利于成骨的环境。最佳的转化时间还受到性别的影响，2019年Nathan等[30]发现，在男性共培养物中从M1过渡到M2的最佳时间为96 h, 而在女性中为72 h, 可能与男性和女性之间类固醇受体的差异有关。

　　4 、总结

　　骨骼系统和免疫系统紧密相关，作为免疫系统中重要的组成部分，巨噬细胞在其中起着关键作用。正确认识巨噬细胞在调控骨形成中的作用机制对于促进骨形成具有重要意义。目前已有大量文献报道，巨噬细胞可通过分泌各种因子来促进骨形成，如OSM、PGE2、BMP-2等，但同时巨噬细胞在成骨中的作用可能不仅仅是通过单一介质起作用，而是多因素的综合作用；另外，巨噬细胞的极化过程在促进成骨中也具有重要意义，阐明其中的作用机制对于未来骨免疫学的发展具有重要意义，同时这些发现也将有助于为治疗骨科疾病提供一种新的思路。

　　参考文献

　　[1] Epelman S,Lavine KJ,Randolph GJ Origin and functions of tssue macrophages [凹] Immunity,2014.41(1):21-35.

　　[2] Pajarinen J,Lin T,Gibon E,et al.Mesenchymal stem cell-macrophage crostalk and bone healing [J] Biomaterials,2019,196:80-89.

　　[3] Gu Q,Yang H,Shi Q. Macrophages and bone inflammation [J]J Orthop Translat,2017,10:86-93.

　　[4] He XT,Li X,Yin Y,et al.The effects of conditioned media generated by polarized macrophages on the cllular behaviours of bone marrow mesenchymal stem cells [J]J Cell MolMed,2018,22(2):1302-1315.

　　[5] Pirraco RP.Reis RL,Marques AP.Effect of monocytes/macrophages on the early osteogenic dfferentiation of hbmscs [J]J Tissue Eng Regen Med,2013,7(5):392-400.

　　[6] Vi L.Baht GS, Whetstone H,et al.Macrophages promote osteoblastic differentiation in-vivo:lmplications in fracture repair and bone homeostasis [J]J Bone Miner Res ,2015,30(6):1090-1102.

　　[7] Schlundt C,EI Khassawna T,Serra A,et al.Macrophages in bone fracture healing: Their essential role in endochondral ossification [J] Bone,2018, 106:78-89.

　　[8] Guihard P,Danger Y,Brounais B,et al.Induction of osteogenesis in mesenchymal stem cells by activated monocytes/macrophages depends on oncostatin m signaling [J].StemCells. 2012,30(4):762-772.

　　[9] Guihard P,Boutet MA. Brounais-Le Royer B,et al. Oncostatin m, an inflammatory cytokine produced by macrophages,supports intramembranous bone healing in a mouse modelof tibia injury [J].Am J Pathol,2015, 185(3):765-775.

　　[10] Ni J,Yuan XM,Yao Q,et al.OSM is overexpressed in knee osteoarthritis and Notch signaling is involved in the effects of OSM on MC3T3-E1 cell proliferation and differentiation [J].Int J Mol Med,2015,35(6):1755-1760.

　　[11] Lu LY,Loi F,Nathan K,et al. Pro-inflammatory m1 macrophages promote osteogenesis by mesenchymal stem cells via the cox-2-prostaglandin e2 pathway [J]J Orthop Res,2017, 35(11):2378-2385.

　　[12] Ninomiya T,Hosoya A,Hiraga T,et al.Prostaglandin E(2) receptor EP(4)-selective agonist (ONO-4819) increases bone formation by modulating mesenchymal cell differentiation [J.Eur J Pharmacol,2011,650(1);:396-402.

　　[13] Pilbeam C Prostaglandins and bone [凹] Handb Exp Pharmacol,2020,262:157-175.

　　[14] Kanayama S, Kaito T,Kitaguchi K,et al.0n0-1301 enhances in vitro osteoblast dfferentiation and in vivo bone formation induced by bone morphogenetic protein J] Spine (Phila Pa 1976).2018,43(11):E616-E624.

　　[15] Horwood NJ.Macrophage polarization and bone formation:A review凹Clin Rev Allergy Immunol,2016,51(1):79-86.

　　[16] Chen Z,Wu C,Gu W,et al. Osteogenic differentiation of bone marrow mscs by beta-tricalcium phosphate stimulating macrophages via bmp2 signalling pathway [J] .Biomaterials,2014,35(5)-:1507-1518.