酸雨胁迫对银杏雌、雄幼苗生长及生理特性的影响

　　近年来, 我国酸雨问题日益严重, 已成为继欧洲和北美之后的全球第三大酸雨重灾区, 受酸雨影响的地区占国土面积的40% (麦博儒等2010)。

　　研究表明, 酸雨会严重影响生态系统的物质循环和能量流动, 酸雨危害所引起的经济损失和对生态平衡及植物本身影响的严重性已越来越引起人们的关注(谢小赞等2009; 金清等2009)。从已有文献看, 针对酸雨对植物影响的研究大多集中于雌雄同株植物, 极少涉及雌雄异株植物。据报道, 雌雄异株植物在全世界约有14 620种, 隶属于被子植物的959个属, 是陆地生态系统的重要组成部分(Renner和Ricklefs 1995)。由于繁殖成本的不同,该类植物的雌、雄个体在形态特征、生理生化特征、资源配置和环境适应性等方面已表现出明显的性别差异(胥晓等2007)。

　　众多学者对雌雄异株植物的研究表明, 在养分贫瘠、生境恶劣或未受人为因素干扰的情况下,某些物种雄株个体数量较多, 生长良好; 但在土壤肥沃、生境良好或受到人为因素干扰的环境中,雌株生长良好, 具有性比优势(胥晓等2007; 尹春英和李春阳2007; Xu等2010)。我们通过总结前人的研究成果发现, 逆境下大多数物种雄株的净光合速率比雌株偏高, 而这些研究对象主要涉及到被子植物, 有关裸子植物的研究甚少。金静等(2008)对20种裸子植物和102种被子植物的光合能力进行比较发现, 裸子植物的光合能力普遍弱于被子植物, 且成年和幼年银杏雌性个体的光合能力强于雄性个体(蒋雪梅等2013)。这是否表明裸子植物与被子植物在抗逆性方面可能存在差异, 且裸子植物银杏雌株的抗逆能力可能强于雄株, 这些问题都有待进一步探究。

　　银杏, 裸子植物, 雌雄异株, 是现存种子植物中最古老的刁遗植物, 有“金色活化石”之称。银杏集食用、药用、保健、化妆、用材、绿化、观赏于一体, 具有较高的经济价值和生态效益(曹福亮2002)。研究还表明, 银杏的抗酸性较强, 是最近筛选出的新抗酸树种(胡晓梅2010)。为了抵抗酸雨胁迫, 重庆范围内大量种植银杏, 效果显著。因此本文以人工种植的银杏雌、雄幼苗作为试验材料,模拟酸雨胁迫对银杏雌、雄幼苗生长及生理特性的影响, 试图了解银杏雌、雄幼苗生长参数、抗氧化酶活性、光合色素和生化物质含量在酸雨胁迫下的响应差异, 从而揭示银杏雌、雄幼苗在抗酸性方面是否存在差异及耐酸阈值, 这也有助于为更好地研究银杏生存历史和如何保护银杏、改善生态环境提供理论参考。

　　材料与方法

　　1、 研究区概况

　　试验地位于四川省南充市郊的西华师范大学生命科学学院试验基地内。南充市地处北纬30°35'~31°51', 东经105°27'~106°28', 整个区域属亚热带湿润型季风气候, 年均温15.8~17.8 ℃, 年平均降雨量约980~1 150 mm, 年均相对湿度76%~86%。

　　2、 材料与试验设计

　　2.1 试验材料

　　试验材料由2008年初当地园林公司提供的二年生银杏(Ginkgo biloba L.)实生苗, 植株的雌雄性别采用溴麝香草酚蓝法进行鉴定(龙程和潘瑞炽1991)。鉴定方法具体为: 取大约0.1 g洁净叶片, 加入3 mL蒸馏水研磨成匀浆, 后吸取一定量的上清液, 加入其4倍的0.1%溴麝香草酚蓝溶液混匀观察,若混合液呈黄褐色为雌株提取液, 混合液仍呈绿色则为雄株提取液。鉴定完后从幼苗中各选取40株高度、长势基本一致的植株, 分雌、雄移栽至内径30 cm、深25 cm的花盆中, 每盆土壤重量控制为8 kg并施加缓效肥12 g (13% N、10% P、14%K), 做好各种管理措施, 让其自然生长。

　　2.2 模拟的酸雨配置

　　模拟酸雨为硫酸型(VSO42-: VNO3-=8:1), pH=3.8~4.0, 依据南充酸雨环境监测数据, 利用H2SO4(98%)与HNO3(75%)按8:1 (V/V)配置成酸雨母液, 用PHS-3TC精密数显酸度计(上海天达仪器公司)进行准确校正, 用自来水稀释配置成pH=3.0、4.0、5.0和5.6的4种酸雨溶液, 分别代表不同程度的酸雨胁迫和对照处理。

　　2.3 试验设计

　　试验采用完全随机设计, 2性别(雌、雄)×4酸梯度(5.6、5.0、4.0、3.0)。待2008年初移栽后的银杏幼苗长势完全稳定后, 于2009年6月10日将所有待处理幼苗全部移入4周通风顶部遮雨的大棚内培养, 次日分别对其进行不同浓度的模拟酸雨胁迫处理试验。每种性别的银杏幼苗随机分成4组, 每组10株。用小型喷雾器在对应植株叶片的正反面分别喷洒pH为5.6、5.0、4.0和3.0的等量模拟酸雨溶液, 每次均喷至叶片滴液为止。喷洒实验每隔5 d进行一次。为防止盆栽银杏土壤干旱,每周对所有试验幼苗浇灌一次等量的Hoagland溶液保持土壤湿度适中。处理时间持续3个月, 整个试验过程除每组喷施的酸雨浓度不同外, 其余环境条件完全保持一致。

　　2.4 测定指标与方法

　　2.4.1 生长及形态方面的测定 雌雄银杏幼苗基径的测定采用数显游标卡尺, 测定点距离土壤表层约5 cm并做好标记, 已便于实验前后测定点为同一位置。叶片相对含水量的测定利用下列公式计算:叶片相对含水量=(FW–DW)/(SFW–DW)×100%(张鸣等2008), 其中, FW: 鲜重; DW: 干重; SFW: 饱和鲜重。比叶面积采用杨鹏和胥晓(2012)的方法:比叶面积=总叶面积/叶干重。叶面积的测定采用SHY-150型活体扫描式叶面积仪, 干重、鲜重及饱和鲜重的测定均采用ACCULAB电子分析天平。

　　2.4.2 生理生化指标的测定 随机选择各种处理下的雌雄植株各5株, 并选取各植株上部第3或4片完全展开的向阳叶片用于测定光合色素含量及比值、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(cata-lase, CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate perox-idase, APX)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量。

　　光合色素的提取: 准确称取0.2 g鲜重叶片剪成细丝状后放入洁净试管中, 加入25 mL混合提取液(配比为V丙酮:V酒精=1:1), 封口后将试管置于暗处直至叶片颜色完全变白。酶提取方法: 取0.3 g叶片于预冷的研钵中, 加入6 mL预冷的缓冲液[磷酸缓冲液, pH 7.8, 含有1 mmol·L-1的乙二胺四乙酸和1%聚乙烯吡咯烷酮]研磨成匀浆, 于4 ℃下离心30min (12 000×g), 取上清液(酶液)用于试验。

　　光合色素含量的测定采用紫外可见分光光度计(李合生2000)。SOD和POD活性的测定分别采用氮蓝四唑比色法(Giannopolitis和Ries 1977)和愈创木酚法(Maehly和Chance 1954)。CAT和APX活性的测定通过Maehly和Chance (1954)以及沈文飚等(1996)的方法。MDA、可溶性蛋白质和游离脯氨酸含量的测定分别采用硫代巴比妥酸比色法(Kramer等2008)、考马斯亮蓝法(Bradford 1976)和茚三酮显色法测定(Bates等1973)。

　　3、 统计分析

　　利用SPSS18.0统计软件进行数据处理。平均值间的比较采用单因素方差分析方法(One-wayANOVA); 多重比较采用邓肯多重范围检验(Dun-can's multiple range test); 对性别与处理之间的交互作用采用多因素方差分析(multivariate analysis)。

　　实验结果

　　1、 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗叶片形态及地上部分生长状况的影响

　　试验现象表明, 在4种不同的处理条件下, 银杏雌、雄幼苗间在叶片形态和地上部分生长状况方面差异并不明显。同对照相比, pH值为5.0的模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗的外部形态并没有造成任何不良影响。然而随着模拟酸雨pH值进一步低至3.0时, 雌、雄幼苗地上长势逐渐变差, 出现某些可见伤害症状, 如叶片颜色由浓绿变浅, 继而部分叶片出现少量黄点; 叶片面积也由大变小, 叶肉由厚变薄直至后来某些叶片叶缘开始卷曲。

　　2、 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗株高和基径增长量的影响

　　如图1所示, 在4种不同条件下, 银杏雌株幼苗的株高和基径增长量均比雄株偏高。总体上, 模拟酸雨具有降低银杏雌、雄幼苗株高和基径增长量的趋势, 且pH值越低, 株高、基径增长量的降低程度越大。与对照相比, pH为5.0的模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗株高和基径的增长并无明显影响;而pH值为4.0和3.0时, 幼苗株高和基径的增长量则显著降低。

　　3、 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗叶片相对含水量和比叶面积的影响

　　如图2所示, 对照条件下, 银杏雌株幼苗的叶片相对含水量和比叶面积均显著高于雄株; 而在pH值5.0、4.0和3.0三种模拟酸雨处理下, 银杏雌、雄幼苗间的叶片相对含水量和比叶面积差异并不明显。总体上, 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗叶片的相对含水量均有一定程度的降低, 而对雄株幼苗的比叶面积具有提高的趋势; 与对照相比, pH值3.0的模拟酸雨显著降低了银杏雌、雄幼苗的叶片相对含水量, 提高了雌、雄幼苗的比叶面积。

　　4、 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗光合色素含量和比值的影响

　　如表1所示, 对照条件下, 银杏雌株幼苗叶片内的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量、类胡萝卜素和叶绿素a/叶绿素b比值均略高于雄株, 但差异并不明显; 在另外3种处理下, 银杏雌株幼苗叶片内的叶绿素a和叶绿素总量也比雄株偏高。总体上, 在4种条件下, 雌、雄幼苗叶片间叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素a/叶绿素b比值的差异均未达到显著水平。同对照相比, 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗叶片内的叶绿素总量和类胡萝卜素含量均有一定程度的降低; 且pH值为3.0的模拟酸雨处理对雌、雄幼苗叶片内叶绿素a和叶绿素总量的降低水平达到了显著差异。

　

　　

　　5、 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗各种抗氧化酶活性的影响

　　如图3所示, 对照条件下, 除APX活性外, 银杏雌株幼苗叶片内的SOD、POD和CAT活性均略高于雄株, 差异并不显著; 在pH值5.0的模拟酸雨处理下, 银杏雄株幼苗叶片的SOD和APX活性略高于雌株, 而在pH值为4.0和3.0两种模拟酸雨处理下, 银杏雌株幼苗的SOD、POD、CAT和APX活性略高于雄株, 但在pH值5.0、4.0和3.0三种模拟酸雨处理下, 雌、雄间各种酶活性的差异并未达到显著水平。总体上, 随着pH值的不断降低, 银杏雌、雄幼苗叶片内的SOD和CAT活性先缓慢升高,在pH值5.0时达到最高值, 之后均呈下降趋势; 与对照相比, pH值为5.0和4.0的模拟酸雨对雌、雄幼苗SOD和APX两种酶活性的影响并不明显, 但pH值为3.0的模拟酸雨显著降低了银杏雌、雄幼苗POD、CAT和APX的活性。

　　6、 模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗丙二醛、游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响

　　如图4所示, 在对照和pH值5.0模拟酸雨两种处理下, 银杏雌、雄幼苗间的丙二醛和可溶性蛋白质含量并无明显差异; 而雄株叶片内的游离脯氨酸含量在4种不同条件下均显著高于雌株。总体上, 随着模拟酸雨浓度的递增, 银杏雌、雄幼苗叶片内丙二醛、游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量逐渐增高; 与对照相比, pH值为5.0的模拟酸雨对银杏雌、雄幼苗叶片内的丙二醛、游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响均不明显, 而pH值为3.0的模拟酸雨显著提高了银杏雌、雄幼苗叶片内的丙二醛和游离脯氨酸含量。

　　讨　　论

　　本试验结果图1和图2-A表明, 银杏雌、雄幼苗地上部整体长势随模拟酸雨浓度的升高而逐渐变差, 如叶片数量、面积、相对含水量和株高、基径的增长量随酸度增大而减少、变小、降低和变慢。在4种不同条件下, 银杏雌株幼苗的增长量均略高于雄株幼苗。由此表明, 酸雨会影响植物的正常生长、阻碍生长发育、降低生长量和产量。当酸雨酸度超过植物的耐酸阈限时, 叶片会出现退绿、失水萎蔫、过早落叶和坏死斑等可见伤害症状, 并随着酸度的递增和淋溶时间的延长加剧受害程度(金清等2009; 谢小赞等2009; 胡晓梅2010), 且在同一酸度的模拟酸雨环境下, 银杏雌株幼苗受到的伤害小于雄株。

　

　　由本文中表1的数据表明, 在4种模拟酸雨处理条件下, 银杏雌株幼苗的叶绿素a和叶绿素总量测定值均略高于雄株。由此可知, 在4种情况下,银杏雌株幼苗叶片的光合色素合成过程受到酸雨的影响较雄株受到的影响要小些。与对照相比,pH值为5.0、4.0和3.0的模拟酸雨在一定程度上对银杏雌、雄幼苗叶片内的叶绿素总量和类胡萝卜素含量有所降低, 且pH值3.0的模拟酸雨对雌、雄幼苗叶片内的叶绿素a和叶绿素总量的降低程度达到了显著水平。这说明高浓度的模拟酸雨会严重破坏植物叶片的结构, 使得叶片受损, 进而影响到广泛分布于叶片中的细胞器, 如叶绿体结构遭到破坏, 类囊体膜明显扭曲, 干扰色素的正常合成,严重时还会加快原有色素的降解, 最终降低色素含量(肖艳等2004)。

　　王开峰等(2005)的研究表明, 在适度逆境条件下, 植物体内氧自由基含量的增加会诱导SOD活性上升, SOD通过歧化反应使超氧阴离子转变为无毒的氧气和毒性较低的过氧化氢, 而过氧化氢又被POD、CAT等酶进一步分解为水和氧气。因此SOD、POD等保护酶在一定程度上能协同消除植物体内过多的氧自由基, 维持活性氧代谢平衡、降低其对膜脂的过氧化程度, 保护膜结构, 提高植物适应胁迫的能力。由文中图3和图4-A的数据结果表明, 银杏雌、雄幼苗叶片内的SOD和CAT活性随pH值的降低, 呈先升高, 在pH值5.0时达到峰值,后下降的趋势; 而MDA含量则随pH值的降低而不断升高。与对照相比, pH为3.0的模拟酸雨显著降低了POD、CAT和APX的活性, 提高了MDA含量。由此表明银杏雌、雄幼苗经过pH值为3.0的模拟酸雨处理后, 其体内活性氧的产生和清除这一动态平衡过程已受到严重干扰, 其生成量已超过了抗氧化酶系统的清除能力, 从而使得细胞膜脂过氧化而产生了大量具有细胞毒性的物质如丙二醛等。

　　逆境下, 植物细胞还可通过积累大量可溶性渗透调节物质来维持细胞形状、保持膜的通透性。在众多的渗透调节物质中, 脯氨酸是唯一能淬灭单态氧、清除羟自由基、稳定蛋白质, 缓解植物免遭毒害的可溶性物质(王丽媛等2010)。对文中图3和图4数据进行分析发现, 在高浓度的模拟酸雨条件下, 雄株叶片内的抗氧化酶活性较雌株均偏低, 而MDA含量显著高于雌株。在可溶性蛋白质和游离脯氨酸含量方面, 银杏雌、雄幼苗叶片内其含量均随酸雨浓度的递增而不断上升;且在pH值3.0的模拟酸雨条件下, 游离脯氨酸含量的提高幅度同对照相比达到显著水平。由此可知银杏雌、雄幼苗为了缓解酸雨带来的伤害, 其叶片内可通过积累较多的游离脯氨酸来清除过多自由基, 降低膜脂过氧化产物; 同时游离脯氨酸和可溶性蛋白质等渗透调节物质的积累还可提高细胞的渗透势, 保持膜的通透性, 维持细胞形状, 提高植物的耐逆性。总体上, 从雄株较低的抗氧化酶活性、较高的膜脂过氧化主要产物MDA含量和能作为活性氧清除剂的脯氨酸含量得知, 雌株的代谢过程受到的影响比雄株要小些。

　　综上所述, 随着模拟酸雨浓度的不断增加, 银杏雌雄幼苗的地上部分可见伤害逐渐出现, 叶片含水量、光合色素含量和抗氧化酶活性逐渐降低,而渗透调节物质含量逐渐升高。与对照相比, 低浓度的模拟酸雨对上述测定值的影响并不明显,而在pH为3.0的模拟酸雨处理后, 大部分测定值的变化幅度达到了显著水平。由此表明, 银杏雌、雄幼苗的耐酸阈值应在pH值4.0~3.0之间。尽管在上述4种处理条件下, 银杏雌、雄幼苗在外部形态方面并无明显差异, 但从各种生理生化指标的测定值进行比较, 银杏雄株内部生理过程受到的干扰要大于雌株。这说明银杏雌株的耐酸能力强于雄株。银杏雌、雄幼苗在耐酸能力方面的差异可能是基因与环境因子共同作用的结果。因此要进一步探究其具体原因还需采用现代分子生物学方法和技术, 从雌、雄植株的分子遗传水平进一步探究银杏雌、雄个体抗酸性差异, 提高植株的耐酸性。

　　参考文献：
　　1.曹福亮(2002). 中国银杏. 南京: 江苏科技出版社．
　　2.胡晓梅(2010). 酸雨胁迫对银杏生理特性的影响[学位论文]. 四川雅安: 四川农业大学．
　　3.蒋雪梅, 戚文华, 肖娟, 胥晓, 陈坚(2013). 盐胁迫下外源脯氨酸对银杏雌雄幼苗生理生化特性的影响. 植物生理学报, 49 (6):579~585．
　　4.金静, 江洪, 余树全, 周国模(2008). 孑遗植物银杏(Ginkgo biloba L.)伴性光合生理特征与进化生态. 生态学报, 28 (3): 1128~1136．
　　5.金清, 江洪, 余树全, 金静, 王艳红(2009). 酸雨胁迫对亚热带典型树种幼苗生长与光合作用的影响. 生态学报, 29 (6): 3322~3327．
　　6.李合生(2000). 植物生理生化实验原理和技术. 北京: 高等教育出版社．
　　7.龙程, 潘瑞炽(1991). 用溴麝香草酚蓝鉴定石刁柏(芦笋)雌雄株. 植物生理学通讯, 27 (3): 204~205．
　　8.麦博儒, 郑有飞, 吴荣军, 梁骏, 刘霞(2010). 模拟硫酸型、硝酸型及其混合型酸雨对油菜生理特性、生长和产量的影响. 植物生态学报, 34 (4): 427~437．
　　9.沈文飚, 徐朗莱, 叶茂炳, 张荣铣(1996). 抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨. 植物生理学通讯, 32 (3): 203~205．
　　10.王开峰, 廖柏寒, 刘红玉, 曾敏, 张永(2005). 模拟酸雨和Zn复合污染对蚕豆生长及其生理生化特性的影响. 环境科学学报, 25(2): 203~207．
　　11.王丽媛, 丁国华, 黎莉(2010). 脯氨酸代谢的研究进展. 哈尔滨师范大学自然科学学报, 26 (2): 84~89．
　　12.肖艳, 黄建昌, 刘少娴, 杨伟钊, 郭冬升, 朱凌志(2004). 模拟酸雨对12种园林植物的伤害及敏感性反应. 西南农业大学学报(自然科学版), 26 (3): 270~273．
　　13.谢小赞, 江洪, 余树全, 刘源月, 原焕英, 李雅红(2009). 模拟酸雨胁迫对马尾松和杉木幼苗土壤呼吸的影响. 生态学报, 29 (10):5713~5720．
　　14.胥晓, 杨帆, 尹春英, 李春阳(2007). 雌雄异株植物对环境胁迫响应的性别差异研究进展. 应用生态学报, 18 (11): 2626~2631．
　　15.杨鹏, 胥晓(2012). 淹水胁迫对青杨雌雄幼苗生理特性和生长的影响. 植物生态学报, 36 (1): 81~87．
　　16.尹春英, 李春阳(2007). 雌雄异株植物与性别比例有关的性别差异研究现状与展望. 应用与环境生物学报, 13 (3): 419~425．
　　17.张鸣, 张仁陟, 蔡立群(2008). 不同耕作措施下春小麦和豌豆叶水势变化及其与环境因子的关系. 应用生态学报, 19 (7):1467~1474．