生理学论文
Morris 水迷宫（ Morris water maze,MWM） 是英国心理学家 Morris 于 20 世纪 80 年代初设计并应用于大鼠学习记忆机制研究的[1],经过不断改进及完善，目前已成为国内外评价动物空间学习记忆能力最常用的实验方法之一，广泛应用于神经药理学、神经生理学、老年病学等基础和应用研究中。
实验动物通常经过一天数次连续数天的训练，可对水下站台产生空间定位记忆，但在具体的操作过程中，训练时程及每天具体的训练次数并没有统一的标准[2].在既往研究中，每天训练次数为 2- 12 次不等，训练时程为 5 - 7 d[3 -9],每天训练的次数对空间学习、记忆的结果有何影响，目前尚没有报道。因此，本实验选取水迷宫实验中应用较多的每天训练4 次及8 次方法，连续训练6 d,探讨训练次数对大鼠空间学习记忆能力的影响，为MWM 实验的进一步完善提供依据。
1 材料与方法
1. 1 实验动物
健康 SD 雄性清洁级大鼠 36 只，体重 190 -230g ,由河南科技大学动物中心提供。动物房室温控制在（ 22 ± 2） ℃，12 h 光照/黑暗周期，动物自由饮水、摄食，大鼠在动物房适应一周后，随机分为每天训练 4 次组（ 4 次/d 组） 和每天训练 8 次组（ 8 次/d组） ,每组 18 只。
1. 2 Morris 水迷宫
Morris 水迷宫实验系统由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和处理分析系统组成（ 成都泰盟科技有限公司研制） .圆形水迷宫水池直径 150 cm,高50 cm,池壁以 4 个等距离点，即东（ E） 、南（ S） 、西（ W） 、北（ N） 将水池分为 4 个象限，分别在 4 个象限的中心沿池壁设置 4 个入水点。圆柱形平台放置于SW 象限的中心位置，并没于水面下约 2 cm.用脱脂奶粉将水搅浑，水温（ 21 ± 1） ℃。用遮光帘将水池围起，布帘上贴有不同形状、颜色的图形作为标记。大鼠头部染黑。训练时将大鼠分别从 4 个入水点头朝池壁轻轻放入，水池上方 1. 5 m 处安放着连接显示系统的摄像机，通过处理分析系统分析可提供动物游泳的潜伏期（ 动物自入水到找到站台后四肢爬上站台时所需的时间） 、游泳距离、游泳轨迹等参数。
1. 3 实验方法
定位航行实验（ 隐藏平台实验） ,连续 6 d.4次/d 组： 每天训练 4 次，随机分别从 4 个入水点入水。8 次/d 组的训练： 每天训练 8 次，每天分 2 个时间段，中间间隔 1 h,每个时间段训练 4 次，分别从 4个入水点入水。在以上大鼠的训练中，每只大鼠每次游泳的时限为60 s,若大鼠在60 s 内找到平台，则记录其从入水到爬上平台的时间（ 即潜伏期） .若大鼠在入水后 60 s 内未能找到站台，则由测试者引至站台，并在站台上停留 15 s,潜伏期记为 60 s.
空间探索试验，实验第 7 天，撤去隐藏平台，从目标象限对面入水点将大鼠面向池壁放于水中，记录 60 s 内大鼠跨越原平台位置的次数、平台所在象限的时间百分比、首次通过平台时间及游泳轨迹等参数。实验过程中应尽量保持实验环境的稳定性，包括测试者、大鼠行为测试时间等，尽量减少可引起大鼠行为改变的干扰因素。
1. 4 统计学分析
每组动物的潜伏期用 x珋 ± s 表示，使用 SPSS16. 0统计软件进行分析，定位航行实验中的潜伏期比较采用重复测量数据的方差分析，游泳平均速度、平台象限时间百分比、跨越平台次数、第1 次通过平台时间采用单因素方差分析，P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 空间学习能力比较
采用定位航行实验中的平均逃避潜伏期及游泳轨迹来评价两组大鼠的空间学习能力，结果显示： 4 次/d 组和 8 次/d 组大鼠在第 1 天训练时的平均 逃 避 潜 伏 期 分 别 为 （ 51. 68 ± 17. 67） s 和（ 48. 29 ± 12. 55） s,差 异 无 统 计 学 意 义 （ P >0. 05） .随着训练次数的增加，两组大鼠的平均逃避潜伏期均明显缩短，4 次/d 组大鼠潜伏期在 5 d后，8 次/d 组大鼠在 3 d 后均稳定在 10 s 左右，8次/d 组大鼠的平均潜伏期在 6 d 的定位航行实验中短于 4 次/d 组大鼠，但差异无统计学意义（ P >0. 05） .根据行为学分析软件计算两组大鼠的游泳速度，差异无统计学意义，说明两组大鼠的游泳能力无明显差异。两组大鼠第 6 天的游泳轨迹均为直线式（ 见图 1） .提示随着训练次数的增加，两组大鼠的空间学习能力均明显增加。
2. 2 空间记忆能力比较
采用空间探索实验中的跨越平台次数、目标象限时间百分比、首次到达平台的时间及游泳轨迹来评价两组大鼠的空间记忆能力。结果显示各项监测指标差异均无统计学意义（ P > 0. 05,见表 2） .两组大鼠在空间探索实验中的游泳轨迹显示，两组大鼠均有明显的目标象限偏好（ 见图 2） .
3 讨论
Morris 水迷宫实验是评价动物空间学习记忆能力的重要手段，实验装置[10]、训练时程[11]、实验时间[12]、游泳时间[13]、水温[14]等因素对水迷宫成绩的影响均已有报道，但水迷宫训练次数对其影响尚没有报道。在水迷宫实验中，动物可通过一定时程的多次训练而获得空间认知，训练次数对空间学习记忆能力的形成非常关键。但在此过程中每天训练次数、训练时程并没有统一的要求，文献报道有每天训练 3 次、5 d 共 15 次[3],每天训练 4 次、6 d 共 24次[4],每天训练6 次、6 d 共36 次[6],每天训练8 次、5 d 共 40 次[7],及每天训练 10 次[8]、12 次[9]等，应用较多的是每天训练 4 次或 8 次。因此，本实验采用每天训练 4 次或 8 次，共训练 6 d,探讨训练次数对空间学习记忆的影响。
定位航行实验主要反映动物空间记忆的获得情况（ 即学习获取能力） .在排除运动障碍的情况下，逃避潜伏期是最为常用且相对稳定的参数[13].在定位航行实验中大鼠通过多次训练寻找平台可以提高大鼠的空间学习能力，同时通过此学习过程建立了空间记忆。本实验两组大鼠的游泳速度无统计学差异，可排除运动能力的影响。定位航行实验结果显示： 每天训练 4 次组大鼠和每天训练 8 次组大鼠随着训练次数的增加，逃避潜伏期均越来越短，而 8次组的平均逃避潜伏期第 1 天至第 6 天均比 4 次组短，但无统计学差异，提示每天训练 4 次共 24 次和每天训练 8 次共 48 次均能明显提高大鼠空间学习能力。8 次组大鼠在水迷宫训练3 d 后，及4 次组大鼠在训练5 d 后，逃避潜伏期稳定在 10 s 左右，提示随着训练次数的增加至 20 -24 次，空间学习能力可以达到饱和，呈现较稳定的状态，而且每天训练次数增加，会使实验动物学习能力提升较快，可以较快达到稳定状态。
空间探索实验测量的是动物的记忆保持能力。空间探索实验结果显示，每天训练 4 次组和每天训练 8 次组大鼠跨越平台的次数及首次通过平台的时间无明显差异，且均表现出明显的目标象限偏好，在目标象限停留的时间均明显高于其他象限，提示两组大鼠的空间记忆能力无明显差异，说明大鼠只要经过“足够”次数的训练，即可达到提取记忆的目的。但游泳训练次数对大鼠长期记忆的影响及作用机制还应进一步探讨。
空间学习与记忆是脑的高级神经生理活动之一，大脑皮层联络区、海马、纹状体、基底前脑、小脑等多个脑区参与其过程，组成一个功能完整的神经网络[15].海马的完整性对于空间学习记忆至关重要[16],但是海马牵涉其中的神经机制并不十分清楚。海马对于空间信息的获得、提取及对记忆的巩固和储存起着关键的作用[17].文献报道，海马损伤大鼠需要增加训练次数才可以达到相对稳定的状态，而正常大鼠经过短期的训练足以达到稳定的学习状态。