sncRNA的结构、功能及影响

　　以往很多研究更为重视的是基因组中的编码序列，而约 98% 的非编码序列是随着对基因组及其功能的研究深入才逐渐引起人们的重视。小分子非编码 RNA（Small non-coding RNAs,sncRNAs） 是 一类核苷酸长度在 20-30 nt 左右的非编码 RNA（Non-coding RNA,ncRNA）[1],过去被认为是剪切加工的剩余产物，近年来的研究发现这一类小分子的生物学功能具有高度的组织特异性或发育阶段特异性，逐渐成为研究的热点。目前主要将ncRNAs分为3类，即 piRNA（Piwi-interactingRNA,与 piwi 蛋白相互作用的 RNA）、microRNA（miRNA,微小 RNA）和 si-RNA（小干扰 RNA）[1].研究发现 sncRNA 参与生殖细胞转录水平、翻译水平上的调控，其中 miRNA和 piRNA 通路是雄性不育动物模型研究中最重要的两条路径[2-4].一般情况下，miRNA 调节精子形成是通过靶向结合在转录本的 3' UTR 区和下调细胞中特定的转录本来促进精子的发育，而 piRNA 则在生精过程中强烈抑制转座子元件的表达。本文综合分析了精子形成过程中相关 sncRNAs 的结构、功能、调控机制以及对动物雄性不育的影响，以期为进一步研究 sncRNA 的调控机制提供参考。
　　
　　1 sncRNA概述

　　真核生物细胞内的 RNA 一般分为编码 RNA 和非编码 RNA.目前发现，人类基因组中有 2% 的序列参与编码蛋白质，即翻译过程中产生的 mRNA属于典型的可编码 RNA,其余为非编码序列[5].

　　sncRNAs 是一类非编码 RNAs,即属于不会编码蛋白质 RNAs（ncRNA）的一部分。而 ncRNA 早在 50 年前就已被发现，1965 年 R. W. 霍利[6]在面包酵母细胞中发现的丙氨酸 tRNA 和之后发现的 rRNA 都是非编码 RNA ;其中 rRNA 含量占总 RNA 的约 82%,随着研究的发展，现在越来越多的新型 ncRNA 得以被发现，如核小 RNA（snRNAs）、小 RNA（miRNA）、与 Piwi 蛋白结合 RNA（piRNA）、长链非编码（lnc-RNA）等。

　　ncRNA 主要从转录来源、分子长度、功能等进行分类。从 ncRNA 转录来源分类，主要有内含子型和基因间型，前者由基因中的内含子序列转录而来，后者主要源于两基因间 DNA 序列的转录[7].ncRNA核苷酸片段同时也具有高度的大小特异性，其中分子长度多于 200 个核苷酸的通常被称作长链 ncRNA,少于 200 个核苷酸的称为短链 ncRNA[8].sncRNAs属于短链 ncRNA,长度在 20-30 nt 左右。它主要包括小干扰 RNA（siRNA）长度在 21-23 nt,微小RNA（miRNA）长度在 19-25 nt,生殖细胞含量丰富的与 piwi（p-element induced wimpy testis）作用的RNA（piRNA）大部分在 24-34 nt[1].sncRNAs 通常与高度守的 Argonaute 蛋白家族结合，该蛋白家族根据结构特异性可要分为两个亚家族 :AGO 和 PIWI ;两类亚家族分别具有两个特殊的结构域，即 PAZ（Piwi-Argnonaute-zwille）域和 PIWI（p-element induced wimpy testis）域[3].在体细胞和生殖细胞中，miRNA、siRNA 一般与 AGO 蛋白家族结合 ;而 piRNA 与 piwi 蛋白结合并且高度富集在生殖细胞中。miRNA 在哺乳动物细胞中的基本功能是负调节 mRNA 的翻译，但是通过 Dicer 敲除实验发现后代生殖细胞中 miRNA 的含量大幅减少[3];还有相关实验通过对猪性成熟前后睾丸组织差异表达miRNA 鉴定及功能分析发现，miRNAs 在动物睾丸发育成熟、生殖细胞的功能分化以及精子发生过程中发挥着重要的作用[9].Watanabe 等[10]研究发现病变的睾丸组织中发现 piwi-RNA 分子的初级加工产物受到影响而次级加工产物未受影响，同时发现piwi 蛋白家族（MILI、MIWI2 和 MIWI 3 个成员）是成功形成精子所必需的一类蛋白家族，在精子形成过程中起到关键作用。miRNA 和 piRNA 都在调节雄性生殖细胞分化过程中起到重要作用。

　　2 sncRNA的结构与功能

　　2.1 miRNA的结构与功能

　　miRNA 是一种约 19-25 nt 长度的高度保守的内源性非编码小分子 RNA,在动物睾丸的发育成熟、生殖细胞的功能分化以及精子发生过程中发挥着重要作用[11].miRNA 以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，主要由基因间隔区、内含子区转录而来[9].这一类 sncRNA 的表达具有组织特异性，但在不同生物体又表现出较高的同源性。

　　大量实验证据表明，miRNA 可能是不同类型的组织细胞调控基因表达的重要元件，尤其是在睾丸组织中，现已发现对精子的发育起到至关重要的作用。大多数哺乳动物的 mRNA 都是 miRNA 的保守靶位，主要是通过与转录修饰后 mRNA 的 3' UTR 区结合来在抑制 mRNA 翻译，与 mRNA 的作用结合部分高达 2-7 个核苷酸 ;这类 sncRNAs 与编码蛋白的基因间有着较大的关联性，因为许多基因编码蛋白都会受到 miRNA 路径的调控[12].在 miRNA 的调控机制中其表达与相关因子呈现负相关，Bj?rk 等[13]发现在睾丸组织中高富含 miR-18,精子形成过程中它的表达与热休克因子 2（HSF2）的表达呈现负相关，曲精小管中抑制 miR-18 的表达会导致 HSF2 蛋白水平增加、调控 HSF2 靶基因的表达。在精子形成过程中，许多组织如何利用 miRNAs 来控制基因的表达，miRNA 通路中 miRNAs 的调控作用和靶位结合，目前这一系列的具体机制尚未明确 ;只是在圆形精细胞的拟染色体上发现了 miRNA 和 miRNA 相关蛋白，miRNA 路径中其他组件蛋白在拟染色体外。

　　miRNA 的编码序列在基因组中全部能够找到，但将近 50% 位于内含子区[14].miRNA 的生成主要是由这部分序列编码的，形成初始 miRNA（pri-miRNA）后经加工成为前体 miRNA（pre-miRNA），最后剪切成为成熟的 miRNA.pri-miRNA 由 miRNA相应的基因序列在 RNA 聚合酶Ⅱ的作用下转录形成的产物，此时在核内的 pri-miRNA 具有一个长的发卡茎环结构，发卡尾部还有两条单链 ;然后被双链 RNA 核酸内切酶 Drosha 切割形成 pre-miRNA 被转运到细胞质[5,10,16,17],pre-miRNA 此时的结构与pri-miRNA 相比是丢失了发卡尾部的单链。细胞质中 pre-miRNA 的茎环区在内切核酸酶 Dicer 的作用下切除，形成成熟的 miRNA,此时 miRNA 仍然具有前体的发卡样结构，只是失去了茎环。随后进入一个具有 AGO 蛋白的核糖蛋白复合体，这个复合体是 miRNA 诱导的沉默复合体（miRISC），在 mRNA翻译中起到靶位锚定作用[16].mRNA 被锁定与否主要根据 AGO 蛋白的类型和 mRNA 与 miRNA 的互补程度[16,17].例如，哺乳动物 AGO 蛋白家族中的AGO2 是唯一能裂解 RNA 的成员，它能在 mRNA-miRNA 高度互补配对的情况下与 mRNA 结合并使其降解[16-18].然而，与 miRNA 互补性较低或者完全不互补配对的 mRNA 被认为是封存在细胞质颗粒内或是翻译抑制。通过 miRNA 引起的翻译抑制机制已经被提出，miRNA 能立即对 mRNA 的 poly-A 尾巴进行脱腺苷化，避免 poly-A 绑定蛋白结合而发生有效翻译[19].此外，AGO2 绑定在修饰过的 mRNA 的 5'端，与真核起始因子 4E（eIF4E）竞争结合位点，从而阻止翻译起始[20],同时 eIF6 阻止功能型核糖体 80s 亚基的形成[21].另一方面，miRNA 也能促进翻译的发生，但是仅限于细胞处于增殖状态或mRNA 靶位的 3' UTR 富含腺嘌呤和鸟嘌呤核糖核苷酸。

　　在小鼠发育早期阶段，让小鼠条件性的失去Drosha 或 Dicer 酶类，精子形成会被阻断，由此睾丸中 miRNA 功能机制的研究对精子发育十分重要。

　　通过部分纯化的生殖细胞或是整个睾丸组织的表达模式研究发现，小鼠或人类的睾丸中都有其特有的miRNA 类群[22-31],其中已发现部分参与哺乳动物精子的形成。

　　2.2 piRNA结构与功能

　　正如前面所提到的，sncRNA 的生物学功能对精子的形成过程至关重要。piRNA 是另一类内源性sncRNA,其核苷酸长度为 24-30 个左右，它的产生不依赖 Dicer 酶，而是与 piwi 蛋白作用[30].随着物种不断的进化，piRNA 基因序列具有较低的保守性，但这类分子仍有活性，在果蝇中，piRNAs 主要存在于胚胎、雌性和雄性生殖系中，编码 piRNAs 的基因主要位于基因组重复区域的转座元件中，piwi 通路在精子形成过程中有沉默逆转录转座子的特定作用[31,32].在哺乳动物中，区别于果蝇，piRNAs 主要富集在雄性生殖系，且编码 piRNAs 基因序列主要存在于不含有转座子等重复序列的未注释的基因间区域内[33].然而，目前对于起源于转座元件外的piRNAs 的功能仍然未知。有实验表明，转座子的控制与精子的发生有关，有利于保护遗传信息的稳定传递[34-36].缺乏 piwi 通路元件的动物模型表现为雄性不育，例如，敲除 MIWI,MILI 或 MIWI2 基因，都会造成小鼠精子产生明显缺陷，表现为雄性不育这也揭示了 piRNA 与精子形成的相关性[30,37].

　　piRNA 具有广泛的多样性，大约有上百万种类别，与仅有几百种的 miRNA 相比数目就显得庞大许多，这种多样性可能主要来源于对前体 piRNA 的剪切加工。在精子形成过程中，piRNA 的序列大小与特异性变化很大，哺乳动物中主要将其分为两类 :