生理学论文
脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是脊柱外科一种致残率很高的疾病，易造成患者运动功能障碍，大小便失禁甚至终身瘫痪[1].现代研究表明，脊髓损伤后，经历第一次原发性损伤及第二次继发性损伤，二次损伤是继发性，是可以预防和治疗的，其重点在于保护残存神经元的功能[2].建立简单、稳定、高效的神经元体外培养是在细胞水平研究脊髓损伤的重要物质基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 出生24h内SD乳鼠，雌雄不限，由安徽医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂 Neurobasal 培养基、B27 无血清添加剂、GlutaMAX-I添加剂、DMEM（high glucose）培养基、灭活胎牛血清、0.25%胰酶、台盼蓝染液均购自Invitrogen公司，多聚-D-赖氨酸、DPBS、Hank's液、抗荧光淬变封片液购自碧云天公司，DNase I、DAPI、Triton X-100购自sigma 公司，神经元相关微管蛋白-2（MAP2）、Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG（H+L）购自abcam公司。
1.1.3 主要器材 24孔细胞培养板、15mm细胞爬片、超净工作台、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜、手术解剖显微镜
1.2 方法
1.2.1 溶液配制 种植培养液：含90%DMEM+10%灭活胎牛血清。维持培养液：98%Neurobasal培养基+2%B27无血清添加剂+0.5mMGlutaMAX-I添加剂。
1.2.2 细胞爬片及细胞培养孔板处理 将灭菌的15mm细胞爬片用DPBS配制的0.1mg/mL多聚-D-赖氨酸溶液浸泡，室温孵育2h,吸弃多聚-D-赖氨酸溶液，蒸馏水洗2遍，晾干待用。
1.2.3 海马神经元的分离 取出生24h内SD乳鼠，75%酒精消毒后断头，依次剪开皮肤、颅骨，迅速取出脑组织置于冰上含有预冷Hanks液的培养皿中。在手术显微镜下分离出两侧的海马区，彻底剥离脑膜及血管。用剪刀剪成约1mm3大小，加入预热的0.05%胰酶，放入37℃消化15min（每7min稍微摇晃一下）。小心吸走消化过组织，用2mL 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基终止消化，加入100μLDNase I,混匀后使用 1mL 枪头上下轻柔吹打 15下，静置2min,吸取上清液。再像沉淀的组织团块中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培养基及100μL DNase I,重复上述吹打步骤。吸取上层细胞悬液，如此重复2次。
70μm细胞筛过滤，1000r/min离心5min弃上清，使用种植培养基重悬，吸100μL细胞悬液后加入100μL台盼蓝染液，于血球计数器下计数细胞，调整细胞密度至2×105个/mL,每孔加入1mL,十字摇板数次，放入培养箱内。以上操作确保在2h内全部完成。4h后使用无血清DMEM培养基洗板镜检细胞碎片基本去除后，换成Neurobasal培养基，后每2d半量换液。
1.2.4 神经元细胞鉴定 取体外培养7d的海马神经元细胞爬片，吸出培养基，PBS洗1次，加入1mL预热多聚甲醛溶液，确保神经突不被破坏，室温孵育10min.PBS洗1次，0.1%Triton X-100通透膜10min.加入10%山羊血清孵育1h后，加入1%血清稀释的MAP2（1∶500），4℃湿盒孵育过夜。加入1%血清稀释的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 IgG（H+L）（1∶1 000），室温避光孵育 1h.DAPI 复染5min后，将细胞爬片反转放至滴有抗荧光淬灭封固液的干净载玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封载玻片边缘，激光共聚焦显微镜观察。
2 结果与分析
2.1 细胞形态的观察 刚接种细胞分散，呈圆形透亮。
4h后细胞已贴壁，部分细胞已伸出短小轴突。1~2d后，细胞明显增大，突起延伸，形成稀疏网络。在培养过程中，神经元之间的纤维联系逐渐丰富，并形成网络。5~7d神经元在倒置显微镜下可见具有明显的光晕，此时神经元胞体呈三角形、椭圆形或多边形，边界清楚，胞体明亮，立体感增强（图1、图2）。2.2 神经元的鉴定 第7天海马神经元固定、封闭后行MAP2免疫荧光染色，结合DAPI核染色，高倍镜下，可见神经元胞体呈多边形，树突、轴突明显（图3、图4、图5）。
3 讨论与结论
神经元是脑及脊髓组织中最基本的组成成分，对神经系统功能的发挥着主要的作用，是脑及脊髓损伤中最常用的细胞，其培养和鉴定技术亦是神经生物学研究中最基本的技术。但是连续的神经元细胞系因无法形成典型的轴突、树突及突触而得不到广泛应用，而原代培养的神经元比传代细胞系更加接近在体状态，是研究工作中较佳的目的细胞，得到了广泛应用。
理论上，原代神经元的培养可通过大脑任何部位及脊髓获取，但海马部位较其他部位神经细胞成分简单，含量多，拥有典型的细胞表型[3-4].传统方法多采用胎鼠进行海马神经元的培养[5-6],其神经分化程度低，便于培养，但由于操作复杂，如进行雌雄鼠配种，计算胎龄，实验时间不可控制，取材时胎鼠表面羊水过多，海马较小等导致操作要求高。而采用乳鼠较胎鼠具有较多的优点，可按照实验按需处死一至数只实验乳鼠，取材较胎鼠简单，无需担心缺氧对胎鼠脑神经元的损害。
在海马神经元培养的过程中，很多因素都会影响原代海马神经元培养的质量，如收集细胞过少，接种时死细胞比例过高，杂细胞过多等，其对实验条件的要求较普通细胞更高。首先，除了消化以外，其他操作均在冰上操作，从解剖至接种细胞控制在2h内完成，尽量减少组织细胞代谢。解剖时，在手术显微镜下尽可能去除海马组织表面所有的血管膜，以免消化后被迫吹打，导致接种时死细胞及杂细胞比例过高。其次，组织在消化前用剪刀剪碎，并使用低浓度0.05%胰酶加适量DNA酶，作用时间控制在15min左右，低浓度胰酶消化能力相对温和，死细胞较少，从而避免使用木瓜酶现用现配的缺点。DNA酶可分解消化过程死细胞释放出来的DNA,避免组织缠结，吹打过程可收获更多单细胞悬液。吹打时，采用分步吹打，慢吸慢吹，动作轻柔，保证每一个单细胞都避免过度吹打，尽可能多地收集细胞。再次，使用含10%灭活胎牛血清重悬、接种细胞，其血清成分可促进细胞生长、增殖，4h后换成含B27添加剂的Neurobasal培养基，换液前轻微震荡，可将多数贴壁不牢固的胶质细胞及细胞碎片去除。
含B27添加剂的Neurobasal培养基其成分确定，培养出的细胞状态均一，选择性促进神经细胞生长，而胶质细胞几乎不分裂。最后，接种板也是决定实验成败的关键因素，接种板密度过低，神经元突触形成过少，无法利用自身分泌促生长因子，同时胶质细胞分裂过多，难以存活和成熟。密度过高，营养相互争夺，细胞容易抱团生长，均会导致实验失败。本实验胶质细胞含量较少，未使用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长，因阿糖胞苷加入时间及剂量难以控制，毒性较大，除了抑制胶质细胞外，对正常海马神经元亦有毒害作用。
综上所述，采用低浓度胰酶消化，差速贴壁及无血清培养新生SD乳鼠海马神经元的方法简单、稳定、高效，可得到高密度的符合体外实验要求的细胞，为神经系统损伤的研究提供了良好的目的细胞。