生物化学论文
摘 要： DNA连接酶是一种能够催化相邻DNA的3’-OH和5’-磷酸基末段形成磷酸二酯键, 并且把两段DNA拼接起来的核酸酶。不同生物体内具有不同种类的DNA连接酶, 可以连接黏性末端或者平末端, 连接过程是通过DNA连接酶把ATP或者NAD的磷酸腺苷接到DNA的缺口处, 形成磷酸二酯键, 在释放出一个磷酸腺苷完成DNA的连接过程, 相对而言对平末端的连接效率较低。
关键词： DNA连接酶; 黏性末端; 平末端; 体外DNA连接;
Abstract： DNA ligase is a nuclease that catalyzes the formation of phosphodiester bonds between 3'-OH and 5'-phosphate terminal segments of adjacent DNA and splices the two segments of DNA together. Different organisms have different kinds of DNA ligases that can connect the viscous end or the flat end. NAD's adenosine phosphate binds to a gap in DNA, forming a phosphodiester bond that releases an adenosine phosphate to complete the DNA connection process, which is relatively inefficient for flat-ended connections.
Keyword： DNA ligase; Sticky ends; Flat ends; DNA connections in vitro;
高中生物中的DNA连接酶首次出现是在必修二第六章第二节“基因工程及其应用”中, 其中介绍“脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口, 需要靠DNA连接酶来‘缝合’”, 从简单的介绍中可以知道, DNA连接酶的作用是连接磷酸二酯键。再次出现时, 是在生物选修三专题一“DNA重组技术的基本工具”中, 这里介绍更为详细, “DNA连接酶—‘分子缝合针’, 将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子, 是靠DNA连接酶来完成的。1967年, 世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条DNA链连接起来的酶, 称之为DNA连接酶 (DNA ligase) 。根据酶的来源不同, 可以将这些酶分为两类:一类是从大肠杆菌中分离得到的, 称为E.coil DNA连接酶;另一类是从T4噬菌体中分离出来的, 称为T4 DNA连接酶。”[1]课本中介绍了DNA连接酶的发现时间、酶的来源及不同DNA连接酶所起的作用, 并提出“连接平末端之间的效率比较低”。虽然选修三的介绍更加详细, 但其中还有很多的信息没有提供, 如连接酶是如何起到连接作用的, 对哪些DNA分子起作用都没有介绍, 而目前高中阶段生物学试题很多是以已知信息的形式提供给学生, 当学生对某些知识不了解的时候很难提取信息并分析问题。这些情况可能会对教学以及学生的理解带来一定的困难。基于此, 本文对DNA连接酶的种类、作用和作用机理进行总结, 以期对教师的教学和学生对DNA连接酶作用过程的理解能起到一定的帮助。
1、 DNA连接酶的发现
DNA连接酶最早于1967年由三个实验室同时发现, 经过科学家几十年的研究发现, 目前在病毒、细菌和真核生物体内都发现了DNA连接酶, 不同类型的DNA连接酶的作用机制不同。一般情况下, 根据DNA连接酶催化反应所需的能量来源可以把DNA连接酶分为腺苷三磷酸 (ATP) 依赖型和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 依赖型, 腺苷三磷酸依赖型DNA连接酶广泛存在于真核生物、古细菌、真细菌和病毒中, 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型DNA连接酶则分布在古细菌、真细菌和病毒中。最近研究发现, 不同类型的DNA连接酶在系统演化上具有一定的联系, 所以研究DNA连接酶, 不仅可以帮助我们了解DNA连接酶在DNA复制、重组和修复中的作用机制, 同时也可以帮助我们研究物种的分布特点和系统演化规律[2,3]。
2、 DNA连接酶的常见种类和作用机制
2.1、 腺苷三磷酸 (ATP) 依赖型
2.1.1、 T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶是目前应用比较多的病毒基因组编码的DNA连接酶, 在基因重组中广泛使用。噬菌体类型较多, 目前研究发现T4噬菌体能够合成T4DNA连接酶, 并且已经能够从被T4嗜菌体感染的大肠杆菌中提取该酶, 此外科学家也已经定位该酶的合成基因, 即噬菌体T4的30基因。T4DNA连接酶具有连接黏性末端和平末端的作用, 研究发现当以切口DNA、黏性末端和平末端DNA为底物时, T4 DNA连接酶对切口DNA的亲和力最大, 而黏性末端DNA的亲和力则大于平末端DNA, 一般情况下T4 DNA连接酶对平末端的连接效率很低。在科学研究中, 为了提高连接平末端的效率, 一般对平末端进行酶切形成黏性末端再进行连接[4]。经过不同科学家的研究, 目前对DNA连接反应的基本机理有基本一致的观点, 即都是通过把双链DNA分子切割后, 暴露出切口, 然后进行连接。研究人员总结DNA片段的连接过程, 认为整个DNA连接反应可以通过三个连续步骤来完成: (1) ATP通过断裂最后一个高能磷酸键释放能量, 同时产生的AMP和T4 DNA连接酶利用ATP水解释放的能量形成E-AMP复合物; (2) 所形成的E-AMP复合物可以识别DNA双链之前被切开的切口, 识别之后AMP会脱离E-AMP复合物并与DNA的5’-P基团结合; (3) 需要连接的另外一段DNA分子片段的3’-OH会攻击第二步形成5’-P-AMP, 3’-OH和磷酸基团残基发生反应形成磷酸二酯键, 同时释放出一个AMP[5]。
2.1.2、 真核生物DNA连接酶
真核生物存在3种ATP依赖型DNA连接酶——DNA连接酶Ⅰ、DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ。研究显示, DNA连接酶Ⅰ和DNA连接酶Ⅳ广泛分布于真核生物中, 如植物界和动物界, DNA连接酶Ⅲ则主要分布于脊椎动物中[3]。
目前科学家认为, 在真核生物DNA复制过程中, 起到连接作用的可能主要是DNA连接酶Ⅰ, DNA连接酶Ⅰ活性的调节与其氨基端有关, 在其氨基端靠近活性中心有一个特定的部位, 该部位可以通过磷酸化作用来调节DNA连接酶Ⅰ的活性。DNA连接酶Ⅰ的作用就是将DNA复制时复制叉处形成的不连续的后随链 (冈崎片段) 连接起来。在此过程中DNA连接酶Ⅰ并不是单独起作用, 而是需要和多种蛋白因子密切合作共同完成。在真核生物DNA复制时, 后随链是由DNA聚合酶α催化合成的, DNA聚合酶α先催化合成一段引物, 然后依赖DNA聚合酶δ与增殖细胞核抗原 (持续复制因子) , 从引物开始合成DNA, 然后引物通过降解出去。此外, 在损伤的DNA的碱基修复中, DNA连接酶Ⅰ也同样起到重要的作用。首先细胞内的特异性的核酸内切酶和外切酶特异性识别损伤部位, 在DNA单链损伤部位的附近进行剪切, 切除一段DNA, 然后DNA聚合酶以另一条完整的DNA链作为模版进行修复合成重新合成这段DNA, 最后由DNA连接酶Ⅰ将缺口连接[2,3]。
哺乳动物DNA连接酶Ⅲ基因编码两种连接酶—连接酶Ⅲα和连接酶Ⅲβ, 这两种酶的区别在C端。DNA连接酶Ⅲ在核苷酸切除修复、碱基切除修复和单链断裂修复等过程发挥作用。
DNA连接酶Ⅳ在非同源重组DNA双链断裂修复和免疫相关基因的重组中发挥功能, 可与某种复合物相互作用, 来维持稳定和催化功能。
2.2、 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 依赖型
在自然界中的其他生物也可以通过以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸供能方式完成此过程, 这种方式主要见于大肠杆菌和其他一些细菌的DNA连接酶的连接反应中。这种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 依赖型连接DNA片段的反应步骤也可以分为三步: (1) 由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与DNA连接酶反应, 形成腺苷酰化的酶; (2) 腺苷酰化酶转移出一分子AMP, 该AMP与切开的DNA分子切口处的5’-P结合, 形成5’-P-AMP; (3) 和ATP依赖型DNA连接反应一样, 即另外一段DNA分子片段的3’-OH攻击第二步形成5’-P-AMP, 3’-OH和磷酸基团残基发生反应形成磷酸二酯键, 同时释放出一个一磷酸腺苷 (AMP) [6]。
3、 体外DNA连接的常用方法
利用目前已知的DNA连接酶的连接特点, 在具体的基因工程操作中, 科研人员对DNA片段的连接方法有以下三种: (1) 用限制性核酸内切酶酶切, 形成具有黏性末端的DNA片段, 利用DNA连接酶直接连接; (2) 对于平末端的DNA片段的连接常利用T4 DNA连接酶连接; (3) 在DNA片段末端加上poly (dA) -poly (dT) 尾, 或化学合成的衔接物或接头, 使之形成黏性末端之后, 再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法的原理基本一样, 都是利用DNA连接酶形成磷酸二酯键来封闭DNA片段之间的间隙。
4、 结语
DNA连接酶在不同生物体中都存在着不同类型的同工酶, 并且都参与生物体内DNA的复制、修复和重组等环节, 是生物体非常重要的酶。通过以上内容的介绍, 可以简单了解DNA连接酶的种类的作用机制, 相信当掌握DNA连接酶的相关信息之后, 对于教学中处理一些知识可以更加得心应手, 同样的学生对DNA连接酶的种类和作用机理的了解对学生解决一些基因工程类题目也起到一定的作用。随着分子生物学的发展, DNA连接酶的研究仍在进行, 很多知识仍在不断地更新, 为了跟上知识的发展和科技的进步, 一线教师的知识储备也要随着科学的发展而更新, 只有如此, 下一代才能更好地面对未来。
参考文献：
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