生物化学论文
糖基化磷脂酰肌醇( glycosylphosphatidylinositol( GPI) -锚定蛋白( APs) 是一类通过羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇锚定在细胞表面而不跨越膜磷脂双层的细胞膜蛋白． 该类蛋白广泛分布在真核细胞表面，独特的结构使其具有水解酶、受体、粘附分子、补体调节蛋白等多种功能． 精子表面 GPI-APs 在精子发生、精子成熟、精子免疫保护、获能及顶体反应、精卵识别、男性不育及生育等生理及病理过程中发挥重要的作用，但精子表面 GPI-APs 的鉴定研究尚不充分和系统． 嗜水气单胞菌毒素( aerolysin) 是由革兰氏阴性嗜水性气单胞菌分泌的外毒素，能与GPI 锚蛋白的 GPI 锚基和 N-glycan 的多糖核心特异性结合． 本研究引入这种能特异性识别 GPI-APs 的细菌毒素作为蛋白生物探针，通过三明治蛋白印迹及免疫荧光的方法鉴定精子表面的 GPI-APs．
1 材料与方法
1. 1 材料
嗜水性气单胞菌株购自中国科学院水生生物研究所; 标准嗜水性气单胞菌毒素( proaerolysin) 购自加拿大萨省大学; 荧光标记的嗜水性气单胞菌毒素FLAER( Alexa-488 Proaeroysin) 购自加拿大 Protox 公司; 嗜水性气单胞菌毒素多克隆抗体( 兔源多抗) 自制; 碱性磷酸酶标记 Protein A/G、PVDF 膜( 0. 45μm) 购自 Pierce 公司; 蛋白酶混合抑制剂( ProteaseInhibitor Cocktail Set Ⅲ) 购自 Calbiochem 公司; 酵母提取物、胰蛋白胨( Tryptone) 购自 OXOID 公司; 弗氏完全佐剂( Freund adjuvant complete) 、弗氏不完全佐剂( Freund adjuvantincomplete) 、TX100、TX114 及PEG20 000 购自 Sigma 公司; 蛋白预染 Marker 购自Fermentas 公司; 硫酸铵( 分析纯) 购自北京化学试剂公司; 其余试剂均为国产分析纯． Sephadex G-100、1. 5 × 100 cm 层析住、2 × 50 cm 层析柱以及 AKTA蛋白色谱纯化及回收系统购自 GE 公司; Spectrapor透析 袋 ( 分 子 截 留 12 000 ～ 14 000 kD) 购 自Spectrum 公司，荧光显微镜购自 Nikon 公司． 新西兰雌性长耳兔购买于北京大学医学部实验动物中心．
1. 2 毒素制备———菌株复苏与扩大培养
无菌吸管吸取0.3 ～0.5 mL 营养肉汤加入到装有真空冷冻干燥的菌种安瓿管内，冻干菌株溶解呈悬浮状． 吸取全部菌体悬液，移植于斜面培养基中，30℃培养箱中培养36 h 后，挑取乳白色菌苔用连续分区划线法接种至培养皿中，继续培养24 h． 挑取培养皿中单个菌落，研磨法接种于盛有5 mL LB 肉汤培养基的50 mL灭菌离心管中，在30℃恒温振荡器中( 150 r/ min) 培养12 h 后倒入 250 mL LB 肉汤培养基，继续培养 36 h，菌液离心3 000 r/min，15 min，上清回收待用．
1. 3 毒素提纯
回收的菌液上清在冰浴条件下，采用硫酸铵沉淀法初步提纯回收毒素． 然后用 Sephadex G-100色谱柱纯化毒素，色谱条件: 平衡液及洗脱液均为50 mmol / L Tris-HCl，pH 7. 8 缓冲液，流速 12 mL / h，按 4 mL/管收集，上样量为柱体积 5% ( 即为 6 mL粗提毒素，上样浓度为 5 ～10 mg/mL) ． 紫外 280 nm进行检测，回收吸收峰段的样品即为提纯的毒素，提纯的毒素装入透析袋埋入 PEG20 000 中浓缩．
1. 4 兔抗毒素多克隆抗体制备
用嗜水气单胞菌毒素( aerolysin) 免疫雌性成年新西兰大耳兔，首次免疫后每隔 2 周加强免疫 3 次，首次免疫将弗氏完全佐剂乳化，加强免疫以弗氏不完全佐剂乳化，每次免疫的毒素蛋白量约为0. 1 mg．3 次加强免疫后，耳缘静脉无菌取血，Western 印迹检测血清抗体的效价，第 8 周再加强免疫 1 次，2 周后颈总动脉取血制备血清．
1. 5 大鼠精子膜脂筏成份提取
分离收集大鼠附睾尾部精子，调节精子悬液浓度至 50 ×106cell / mL，用 TX114 膜蛋白提取液提取大鼠精子膜蛋白，冷丙酮沉淀浓缩备用．
1. 6 多克隆抗体的 Western 印迹鉴定
纯化后的 aerolysin 进行 12% SDS-PAGE，蛋白电转移至 PVDF 膜，以溶解于 TBS 的 5% 脱脂牛奶，室温封闭 30 min，用上述制备的多克隆抗体以及阴性对照血清( 免疫前) 4℃孵育过夜． TBS-T 洗膜，以碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG 室温孵育 2 h，洗膜后以 BCIP/NBT 显色试剂盒显色．
1. 7 精子膜表面 GPI 锚蛋白鉴定
1. 7. 1 Sandwich Western 印迹鉴定精子膜表面 GPI锚蛋白 上述提取到的精子膜蛋白进行 12% SDS-PAGE，电转移至 PVDF 膜，以溶解于 TBS 的 5% 脱脂奶粉室温封闭 30 min，加入制备的毒素( 5% TBS脱脂奶粉 1∶ 500 稀释) 4℃孵育过夜，TBS-T 洗膜，加入上述制备的多克隆抗体( 稀释同前) 室温 4 h，TBS-T 洗膜，以碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG 室温孵育 2 h，洗膜后以 BCIP/NBT 显色试剂盒显色．
1. 7. 2 免疫荧光检测精子膜表面 GPI 锚蛋白 取大鼠附睾精子，用 4% 多聚甲醛 4℃静置过夜，充分固定精子，调整精子密度为 1 × 106cell / mL． 按1∶ 100比例将 FLAER 加入到精子悬液，避光冰上孵育1 h，然后加入 PI 衬染液，继续避光冰上孵育1 h．孵育结束用预冷的 PBS 洗涤后重悬精子，取 20 μL精子悬液均匀涂在载玻片上，干燥后用含 2% 抗荧光淬灭剂的甘油封片液封片，荧光显微镜油镜下观察并记录图像资料: 激发波长 490 nm．
2 结果
2. 1 嗜水气单胞菌菌株复苏培养
冻干菌株经斜面培养管复苏并接种到普通营养肉汤培养皿中，30℃培养 24 h 后，培养皿中长出单个2 mm 左右凸起的灰白色光滑湿润的菌落( Fig． 1) ，菌落有淡香气味．
2. 2 嗜水气单胞菌毒素的提纯
经过 Sephadex G-100 色谱柱对硫酸铵分级沉淀的嗜水气单胞菌毒素提纯，发现在 2. 5 h 时开始出现洗脱峰，至 4 h 时洗脱峰降至基线附近，洗脱峰为单一峰值( Fig． 2) ． 洗脱液浓缩后的 SDS-PAGE 图谱显示在 45 kD 附近有一明显蛋白条带( Fig． 3) ．【2】
2. 3 多克隆抗体效价的 Western 印迹鉴定
Aerolysin 多克隆抗体与嗜水气单胞菌毒素提纯液及购买的毒素杂交后，均在毒素蛋白相应位置( 40 ～55 kD) 出现明显条带，阴性对照血清与毒素杂交后未出现相应条带( Fig． 4).
2. 4 精子膜表面 GPI 锚蛋白的鉴定
2. 4. 1 精子膜脂筏成分的 Sandwich Western 印迹
结果 嗜水气单胞菌毒素和制备的 aerolysin 多克隆抗体与 2%TX114 裂解液提取的精子膜蛋白脂筏成份经过 Sandwich Wester-blot 杂交后，在10 ～130 kD之间出现明显 12 条左右的蛋白条带，且本实验纯化的毒素及购买的标准毒素识别的蛋白条带分子质量位置一致( Fig． 5) ．
2. 4. 2 精子表面 GPI 锚蛋白的 FLAER 荧光检测
使用 FLAER( Alex488 标记的 aerolysin) 直接标记附睾头部和尾部精子后，荧光显微镜下可看到在精子的头部和鞭毛段均有 GPI 蛋白分布( Fig． 6) ．
3 讨论
嗜水性气单胞菌是革兰氏阴性球杆状细菌，属于致病菌，是导致鱼类死亡的主要菌类，其所含嗜水气单胞菌毒素( aerolysin) 能特异与 GPI 锚基的糖链结合． 由于目前尚无市售的 aerolysin，本实验通过嗜水性气单胞菌株培养物经蛋白质化学技术及原理纯化了嗜水气单胞菌毒素，自制了兔抗嗜水性气单胞菌毒素多克隆抗体． 通过与国外大学制备的标准毒素比较，确认了纯化毒素及自制抗体的特异性的有效成份与纯度． 并使用纯化毒素和自制抗体对精子表面 GPI 锚蛋白进行初步鉴定． 本实验结果显示，自制的兔抗嗜水气单胞菌毒素多克隆抗体效价高( 工作浓度为 1∶ 1 000) ，特异性好，可以用于后期的实验．
本研究验证了理论假说: 嗜水气单胞菌毒素能识别精子表面的 GPI-APs，并为精子表面GPI-APs 的深入研究提供了实验材料及方法基础．精子表面的 GPI-APs 部分是在精子发生过程中由精子细胞自行合成并表达的，其它的精子表面GPI-APs 则是转移并整合到精子表面的． 雄性生殖管道中，附睾在精子成熟、贮存和保护中起重要作用，附睾上皮细胞合成并分泌各种蛋白质，包括很多 GPI-APs，它们通过微囊泡( 附睾小体) 转运，整合到精子细胞膜表面，使精子获得新的蛋白成分． 本实验中使用 FLAER 直接标识精子表面的GPI-APs，为 GPI-APs 的鉴定及细胞定位提供初步信息．
结果( Fig． 6) 显示，附睾头段和尾段荧光强度的不同也在一定程度上验证了附睾精子从附睾头运行至附睾尾时，有新的 GPI 锚蛋白成份添加到精子表面，主要分布在精子头部及精子尾部． 但是精子在附睾的穿行中，移行 GPI-APs 的定位、结构、功能及其具体机制有待进一步研究．
本实验探索性地对精子表面的 GPI-APs 进行了初步分析． 研究结果表明，嗜水气单胞菌毒素能够有效识别精子表面的 GPI-APs，验证了其可以作为生物探针鉴定精子表面的GPI-APs 的假说; 同时，还制备了后期实验所需的主要实验工具，为 GPI-APs 蛋白的鉴定及功能研究奠定了基础．