生物化学论文
低聚异麦芽糖包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等，α–葡萄糖苷酶（α-transglucosidase,E.C.2.4.1.24）可转移葡萄糖基到麦芽糖、葡萄糖等底物分子上进而获得低聚异麦芽糖。研究[1]发现，产α–葡萄糖苷酶较高的微生物主要是黑曲霉（Aspergillus niger），目前的研究主要集中在酶基因的克隆及高效表达[2–4]方面，而针对不同基因编码的酶的性质比较及转苷应用分析报道较少。α–葡萄糖苷酶同时具有水解和转苷两种活性，不同的α–葡萄糖苷酶所表现出的这两种活性具有较大的差异。在低聚异麦芽糖生产中，针对不同生产目的，如对低聚异麦芽糖产品不同成分、不同浓度、不同纯度等的要求，需要选择具有不同转苷活性或水解活性的酶。GenBank 中已报道的编码α–葡萄糖苷酶基因有 7 个，这 7 个基因之间 DNA 相似性程度较低，不到 40%,氨基酸序列相似性也只有 25%左右，为了分析这些不同的α–葡萄糖苷酶的功能和应用特性，本文选取其中 DNA 和氨基酸序列相似度较高（均在 50%左右）的两个α–葡萄糖苷酶 A（Glu-A）和α–葡萄糖苷酶 B（Glu-B）为研究对象，首先实现了这两个酶在毕赤酵母中的高效表达，并主要对这两个酶的酶学性质及转苷作用进行比较分析，为研究其他几种酶的酶学性质和酶的功能与结构之间的关系奠定基础，也可为α–葡萄糖苷酶在低聚异麦芽糖生产中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 菌株
毕赤酵母工程菌 P. ,pastoris A、P., pastoris B,由本实验室保存。
1.2 培养基
YPG 固体培养基：酵母粉 5,g、蛋白胨 10,g、甘油10,g、琼脂 5,g,溶解于 500,mL 水中。121,℃灭菌20,min.
BMGY 培养基：酵母粉 5,g、蛋白胨 12,g,溶解于420,mL 水中。121,℃灭菌 20,min.冷却至室温加入60,mL 1,mol/L 的磷酸钾缓冲液、60,mL 酵母氮源、1.2,mL 生物素溶解液、60,mL 甘油溶解液。
BMMY 培养基：酵母粉 6,g、蛋白胨 12,g,溶解于 420,mL 水中。121,℃灭菌 20,min.冷却至室温加入 60,mL 1,mol/L 的磷酸二氢钾–磷酸氢二钾缓冲液、60,mL 酵母氮源、1.2,mL 生物素溶解液、60,mL甲醇溶解液。
1.3 酶活的测定方法
采用 QB 2525-2001《食品添加剂·α–葡萄糖转苷酶》的方法进行酶活的测定：用α–葡萄糖苷酶作用底物α–甲基–D–葡萄糖苷生成葡萄糖，所生成的葡萄糖与含有葡萄糖氧化酶、过氧化物酶的 4–氨基安替比林和酚试剂进行显色反应来定量测定。在此实验条件下，在 2.5,mL 上述混合物的反应体系中，60,min 产生 l ?g 葡萄糖所需的酶量定义为一个α–葡萄糖苷酶活力单位。
1.4 酶学性质分析
1.4.1 酶的最适反应温度及稳定性将两种毕赤酵母工程菌产α–葡萄糖苷酶酶液取2,mL 分别置于 10~90,℃的条件下取样测定酶活，以最高酶活为相对酶活 100%.在 pH 5.0 条件下，将酶液在不同的温度下保温 0.5,h,将不进行温度处理的酶液作为相对酶活 100%.
1.4.2 酶的最适反应 pH 及稳定性在 4,℃反应条件下，用磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液配制 pH 分别为2、3、4、5、6、7、8、9,质量浓度为 20,g/L 的α-甲基-D–葡萄糖苷底物溶液。测定两种酶的酶活力。以最高酶活计为 100%.在室温条件下，将酶液分别置于不同 pH 条件下，保温 0.5,h,测定酶活力，将未进行处理的酶液计为 100%.
1.5 转苷实验及产物成分分析
用 pH 为 5 的缓冲液配制质量浓度为 200,g/L 的麦芽糖溶液 50,mL 装入 250,mL 三角瓶中。α–葡萄糖苷酶加酶量为 36,U/mL,封住瓶口，将三角瓶置于55,℃水浴摇床进行转苷反应 30,h.取样测定各种低聚糖的含量，分析转苷结果。
转苷产物成分分析采用高效液相色谱法。色谱条 件 :Prevail Carbohydrate 色 谱 柱 （250,mm ×4.6,mm），流动相为体积分数 75%乙腈水溶液，柱温30,℃ ,流 量 1,mL/min ,进样量 10,?L ,蒸 发温度90,℃，蒸发气体流量 2.0,L/min.
2 结果与分析
2.1 两种α–葡萄糖苷酶酶学性质
2.1.1 最适温度及温度稳定性温度对两种α–葡萄糖苷酶的酶活力影响
结果如图 1 所示。由图 1 可知：两种α–葡萄糖苷酶的最适反应温度均为 50,℃。在温度大于 30,℃时，酶活力迅速上升，在 40~60,℃酶活保持较为稳定状态。当温度超过 60,℃时，两种酶的酶活均迅速下降。α–葡萄糖苷酶 Glu-A 在 80,℃时就已经失活，而 Glu-B 在80,℃时的酶活也很低，在 90,℃时完全失活。将两种酶液在不同的温度条件下保温 0.5,h 后，测定酶活力结果如图 2 所示。在 10~60,℃时两种酶酶活力保持相对稳定状态，Glu-A 稳定性高于 Glu-B.在温度高于 60,℃时，酶活力迅速下降。2.1.2 最适 pH 及 pH 稳定性pH–酶活力曲线如图 3 所示。pH–酶活力稳定性曲线如图 4 所示。由图 3 可知：α–葡萄糖苷酶 Glu-A 的酶活最适pH 为 5,α–葡萄糖苷酶 Glu-B 的酶活最适 pH 为6.由图 4 可知：Glu-A 的 pH 稳定范围为 5~6,稳定范围较窄，当 pH 低于 5 或高于 6 时，酶活力迅速下降。Glu-B 的 pH 稳定性范围较宽，在 pH 5~7 之间均能保持一定的酶活力。
2.2 转苷作用及产物分析
利用麦芽糖作为底物，配制质量浓度为 200,g/L的麦芽糖溶液，加入α–葡萄糖苷酶进行转苷反应。反应结果用高效液相色谱（HPLC）进行分析[5],两种α-葡萄糖苷酶转苷麦芽糖结果如图 5、图 6 所示，生成率数值见表 1.【1】
通过图 5、图 6 及表 1 可以发现，不同目的基因来源于黑曲霉的两种毕赤酵母工程菌所产α–葡萄糖苷酶转苷麦芽糖的结果不同。Glu-A 转化麦芽糖生成潘糖的效率最高，潘糖的生成率达到了 31.41%,其次为异麦芽糖的生成率为 15.79%,最低为异麦芽三糖，生成率为 4.18%.Glu-B 转化麦芽糖生成的产物中异麦芽糖及异麦芽三糖的生成率较高，分别为 16.71%、15.85%,潘糖最低，为 4.15%.这一结果可能是由于这两种不同的α–葡萄糖苷酶基因序列的差异，以及氨基酸组成的不同而导致转苷过程中对葡萄糖苷元的偏好不同，出现了不同的转苷结果[6].
3 讨 论
通过对本实验室保存的毕赤酵母重组菌株P.,pastoris A 和 P.,pastoris B 所表达的α–葡萄糖苷酶酶学性质进行研究发现，两种酶的酶学性质基本相同。Glu-A 和 Glu-B 的最适温度均为 50,℃，10~60,℃时酶活力均保持相对稳定状态。最适温度比报道中黑曲霉所产的α–葡萄糖苷酶最适反应温度 55,℃略低[7].两种酶的最适 pH 分别为 5、6;pH 稳定性范围分别为 5~6 和 5~7,pH 稳定范围具有一定的差异性，Glu-B pH 稳定范围较 Glu-A 的 pH 稳定范围宽。日本田野制药株式会社所生产的α–葡萄糖苷酶最适反应温度为 65,℃，最适 pH 为 5.0[8].在转苷作用方面，不同基因编码的α–葡萄糖苷酶具有不同的转苷效果，Glu-A 和 Glu-B 转苷麦芽糖后，总低聚异麦芽糖生成率分别为 51.04%和 35.85%,Chen 等[9]从黑曲霉中获得α–葡萄糖苷酶基因构建载体并在毕赤酵母工程菌中表达，所得酶以异麦芽糖为底物进行转苷反应，总低聚异麦芽糖生成率为 26%.本文中的Glu-A 偏向于将α–1,4 糖苷键打开，使游离出的葡萄糖残基转移到麦芽糖上形成α–1,6 糖苷键，因而麦芽糖转苷产物中潘糖的量高。而 Glu-B 则偏向于将α–1,4 糖苷键打开，使游离出的葡萄糖残基转移到葡萄糖和异麦芽糖上形成α–1,6 糖苷键，最终转苷产物中异麦芽糖及异麦芽三糖的量较高。本实验证实 Glu-A和 Glu-B 虽然都来源于黑曲霉，但α–葡萄糖苷酶的酶学性质及转苷作用存在着一定的差异性，这将为利用不同α–葡萄糖苷酶转苷作用生产低聚异麦芽糖的研究提供依据和参考。【其它图略】
参考文献：
[1] 童星，唐秋嵩，吴玉飞，等。 黑曲霉α–葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J]. 微生物学报，2009,49（2）：262–268.
[2] 谢振荣，幕跃林，颜丽娟，等。 α–葡萄糖苷酶高产菌株HB-9-5 的选育及产酶条件的优化[J]. 生物技术通报，2010（6）：206–211.
[3] 杨捷琳，孟逊，黄应峰，等。 阪崎肠杆菌α–葡萄糖苷酶基因克隆、表达及活性研究[J]. 食品科学，2008,29（2）：213–217.
[4] 王继瑞，张云开，覃晓娟，等。 α–葡萄糖苷酶基因序列分析及真核表达载体的构建[J]. 生物技术，2009,19（5）：1–4.