生物制药论文
蛇毒是由毒蛇毒腺分泌的一类天然毒液,含有多种蛋白质、多肽、酶类和其它小分子物质,具有广泛地生物学活性,常作为天然药用资源库进行研究。随着药理学、毒理学和药物学的发展,蛇毒酶类在抗血栓、止血、镇痛、降压及抗肿瘤方面表现出很大的潜力。根据酶活力中心特点,蛇毒酶类分为丝氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类; 根据活性功能分为蛋白水解类、抗凝血类、促凝血类和激肽释放类。其中蛇毒类激肽释放酶,是与激肽释放酶性质相似的一类丝氨酸蛋白酶的总称,能作用激肽原生成激肽,具有扩张血管,改善微循环和调节血压等作用; 同时还可以作为活化因子,激活纤溶酶原,提高纤溶系统和胶原水解酶活性,起到防止血凝,抗血栓形成,该酶对开发为心脑血管疾病治疗药物具有重要的应用前景。目前对蛇毒类激肽释放酶的综述报道尚属空白,本文就其分布、分离制备、生化性质、药效研究以及此领域的研究进展等做一详细综述,为今后蛇毒类激肽释放酶的研究提供参考依据。
1、 蛇毒类激肽释放酶的分布
1948 年,Rocha 等首次在矛头腹 Bothrops jarara-ca 蛇毒中发现了类激肽释放酶,与血液共同孵育时表现为一种平滑肌舒张物质,而将其注入动物体内会引起血压的下降,此后激肽释放酶广泛在哺乳动物的血浆和胰脏等腺体组织中发现。迄今为止,研究人员已经在响尾蛇属、腹亚科、蝰亚科和眼镜蛇科等种属的30 余种毒蛇蛇毒中都分离得到了类激肽释放酶。Os-hima 等根据精氨酸酯酶及类激肽释放酶的活性,指出类激肽释放酶在腹亚科蛇毒中的活力最高。Abdus-alam 等研究了响尾蛇属、蝰亚科、眼镜蛇科等 15 种毒蛇蛇毒的激肽酶、酪氨酸酯酶、精氨酸酯酶及激肽释放酶的活性,指出所有响尾蛇属和蝰亚科蛇毒中都含有类激肽释放酶的分布,而在蝮亚科 Agkistrodon halysussuriensis 中活性较高,与前人研究结果一致。
2、 蛇毒类激肽释放酶的分离纯化及制备
传统的蛇毒酶类主要采用色谱法进行分离纯化,类激肽释放酶也是如此,包括离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法,并结合亲和层析辅助纯化完成。常用的阴离子交换剂有 DEAE-葡聚糖凝胶和 DEAE-纤维素等,葡聚糖凝胶有 SephadexG-100 和 SephadexG-75 用作分离。随着分子生物学的发展,利用基因工程技术对蛇毒酶类进行重组表达的技术越来越成熟。目前已有多种蛇毒酶类获得了具有活性的重组表达产物,如来自南美洲矛头蛇毒中的降纤酶和止血酶 Batroxobin,菜花烙铁头蛇毒中的纤溶酶 Jerdonitin 和绿蝮蛇毒中的抗血小板凝集的金属酶 Albocollagenase 等。
相应的,蛇毒类激肽释放酶的重组表达也有相关研究。Huang 等将烙铁头蛇毒激肽释放酶基因与两个限制性内切酶切位点 BamH I、Pst I 和组氨酸标签基因构建克隆到载体 pQE30 后,转入 E. coli M15 中进行原核表达,表达产物经免疫杂交、液相色谱分析、电喷雾质谱和 N 端氨基酸分析验证,结果表明重组表达类激肽释放酶 Tm-5 与天然烙铁头蛇毒激肽释放酶结构一致,且对天然 Tm5 的底物 N-benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide 具有很高的活性,表明重组类激肽释放酶Tm 表达成功。Wang 等首次报道了将江浙蝮蛇蛇毒类激肽释放酶基因克隆到 pCS2 +表达载体后,转入小麦麦胚无细胞表达系统进行表达,通过对载体、RNA聚合酶浓度、磷酸肌酸和 Cu2 +等条件的优化,表达的重组表达激肽释放酶活性为 1. 3 U/mg,能达到天然蛇毒激肽释放酶活性( 1. 74 U/mg) 的 75%,得到了具有相对高活性的无细胞表达的类激肽释放酶,为无细胞表达载体的应用前景提供了依据。
3、 蛇毒类激肽释放酶的生化性质研究
哺乳动物体内有两种激肽释放酶: 组织型激肽释放酶和血浆型激肽释放酶。组织型激肽释放酶作用于高分子量激肽原和低分子量激肽原,均释放胰激肽,血浆型激肽释放酶只作用高分子量激肽原释放缓激肽。大部分来自腹亚科和响尾科蛇毒的激肽释放酶与血浆型激肽释放酶特异性一致,只作用于高分子量激肽原释放缓激肽,然而来自原矛头蝮属毒蛇蛇毒的 elegaxo-binⅡ与组织型激肽释放酶特异性一致,能够分别作用于高分子量和低分子量激肽释放胰激肽。激肽释放酶在哺乳动物体内都是酶原形式存在的,要经蛋白酶作用后剪切,去掉氨基端的 6 个氨基酸残基形成活性形式后才能发挥生物活性,而蛇毒类激肽释放酶与其不同,不需要激活,直接可以用于激肽原释放激肽,引起下游的生物学反应。
目前发现的类激肽释放酶均属于单体糖蛋白,分子量约为30 ~35 kD。糖链结构主要有海藻糖、己糖和唾液酸等,其所占蛋白分子量的比例均有不同,来自Agkistrodon caliginosus 类激肽释放酶的糖链比重为10. 1%,而来自 Agkistrodon halys Pallas 的糖链为23. 3%。目前糖链结构对类激肽释放酶作用机制的影响不是很明确,可能会对蛋白结构起稳定作用,而在某些酶如 LV-Ka 中,通过糖苷酶 F 去除所有糖链时,其失去了 90% 酰胺酶的活性,表明糖链结构直接参与了底物分子的识别,但是对其精确的糖链结构及相关作用机制尚未有报道。
许多蛇毒类激肽释放酶同时具有两种或两种以上的酶活力,如来自响尾蛇属的 Taiwan habu 蛇毒中的纤溶酶同时具有激肽释放酶活性,蝰亚科的 Bothropsjararacussu 蛇毒中的 BjussuSP-I 同时具有凝血酶、促凝血酶和激肽释放酶 3 种活性,自 Crotals mantes 的crotalase,竹叶青属 Trimeresurus elegans 蛇毒中的 eleg-axobin II 都同时具有凝血酶和类激肽释放酶活性,而 LV-Ka 除对 S-2302 和 S-2266 具有特异性,研究也发现当将其与纤溶酶原孵育时会对底物 Tos-Gly-Pro-Lys-pNA 水解,说明其兼有激活纤溶酶原活性,而对凝血酶底物 S-2238 和纤溶酶底物 Tos-Gly-Pro-Lys-pNA 不具有酶解活性。蛇毒类激肽释放酶对激肽释放酶底物 S-2302 和 S-2266 均具有较高的特异性和酶活性,同时对甲苯磺酰精氨酸甲酯( TAME) 和苯甲酰精氨酸乙酯( BAEE) 也具有水解活性,并可被二异丙基氟磷酯( DFP) 和苯甲基磺酰氯( PMSF) 所抑制,也显示其作为一种丝氨酸蛋白酶的本质。
4、 蛇毒类激肽释放酶的结构研究
迄今为止,科学家研究报道了近 10 种蛇毒类激肽释放酶的全部或部分氨基酸序列,包括来自蝮蛇 Agkis-trodon caliginosus 蛇毒的 KR-E-1,江浙蝮蛇 Agkistrodonhalys pallas 蛇毒的 AHP-Ka,矛头蝮蛇 Bothrops jararaca蛇毒的 BjussuSP-I,花蝮蛇 Agkistrodon halys blomhoffii蛇毒的 Halystase,以及来自响尾蛇属 Prairie rattlesnake蛇毒和蝰亚科 Aspic viper 蛇毒中的类激肽释放酶,相对于蛇毒中的类凝血酶、类纤溶酶和神经毒素等活性蛋白的报道,类激肽释放酶的研究相对薄弱一些。Matsui 等首次报道了从花腹蛇毒中分离得到的类激肽释放酶( Halystase) 的完整氨基酸序列,其与激肽释放酶的同源性为 42%,与凝血酶为26% ,与蛇毒类凝血酶为 66% ~ 72% ,并表现出一些溶血纤蛋白原的活性,优先作用于血纤蛋白原 B 链的Arg4 位,并能缓慢降解 A 链,但不生成血纤肽 A 或 B,不能形成正常的血凝块,因此 Halystase 诱导了降低血压和阻碍血液凝固两个作用。Sant,Ana 等对 Both-rops jararaca 蛇毒的 BjussuSP-I 的分子特性进行分析,表明 BjussuSP-I 具有其它蛇毒丝氨酸蛋白酶家族的保守序列,并有利证明了酶分子的糖链对于其活性发挥重要作用,而且会成为蛇毒来源酶类物质生物活性优化的最重要特性。Oyama 等[27]对 Agkistrodon caligino-sus 蛇毒的 KR-E-1 的氨基酸序列进行详细分析,结果表明其包含 235 个氨基酸,具有丝氨酸蛋白酶家族的保守序列( His57,Asp102,and Ser195) ,在 36 号氨基酸位置具有 N 连接糖基化位点。KR-E-1 的氨基酸序列与组织激肽释放酶,牛凝血酶 β 链,KN-BJ 2,elegaxobin和 elegaxobin II 的同源性分别达到了32%、31%、65%、65% 和 67% 。1 ~ 50 号氨基酸都属于疏水性氨基酸,73 ~ 101 号氨基酸包含许多赖氨酸残基,而此特征是此酶与其它蛇毒丝氨酸蛋白酶和人类激肽释放酶的不同之处。在其一级结构序列中,酶活力中心 Ser195之前有 6 个天冬氨酸残基,这种保守序列也同样出现在以上 5 种酶的一级结构序列中,这都表明它们都具有胰蛋白酶家族的特异性。
研究人员对蝰亚科和腹亚科蛇毒丝氨酸蛋白酶研究发现: 1) 具有高度的序列相似性,其催化中心的 3 个氨基酸残基 His57,Asp102和 Ser195有一致的几何学定位; 2) 一级序列同源性高,N 末端通常为 V-X-G-G-D-E-C-N-I-N-E-H; 3) 分子中都存在 12 个半胱氨酸形成的 6 个二硫键,分别位于 Cys22 - Cys157,Cys42 -Cys58,Cys92 - Cys245,Cys136 - Cys201,Cys168 -Cys182,Cys192 - Cys157; 4) 活性中心外第 59 ~ 68,93~ 101,169 ~ 180 号氨基酸是 3 个高度变异的可变区,但这些区域的功能尚不明确,但该差异造成了类激肽释放酶、类凝血酶和类纤溶酶等蛇毒酶底物专一性的差异,进一步体现为生物学和药理学功能的差异。
5、 蛇毒类激肽释放酶的药理药代研究
相对于已经广泛应用于治疗凝血和血栓性疾病的蛇毒酶类药物如类凝血酶和类纤溶酶,蛇毒类激肽释放酶的药理药代研究相对薄弱,主要集中在促进细胞增殖和改善血液微循环等研究方面。杨壮来采用白眉蝮蛇毒激肽原酶研究对脑缺血再灌注大鼠模型进行研究,结果表明蛇毒激肽原酶能明显增加脑缺血再灌注大鼠缺血区血管上皮细胞的表达,促进血管的增生,从而对缺血区的神经再生和神经保护发挥重要的作用。伊力哈木江 - 依马木等采用白眉蝮蛇毒激肽原酶研究对糖尿病大鼠模型的血液学变化,结果显示蛇毒激肽原酶能明显降低糖尿病大鼠的全血黏度以及血小板的聚集率,表明蛇毒激肽原酶具有减少红细胞聚集,降低血液黏滞度,改善血瘀症状和红细胞变形能力,改善血管病变,而达到防治糖尿病血管病变的作用。Zhou 等利用双抗夹心 ELISA 方法对 Agkistr-odon halys pallas 蛇毒中的 AHP-Ka 在 SD 大鼠中的药代动力学进行研究,结果表明其在 SD 大鼠血浆中的半衰期约为 56 min,代谢趋势符合一室开放模型,揭示了AHP-Ka 在 SD 大鼠血浆中的药代动力学特点和代谢趋势,为后期 AHP-Ka 进行临床前药代动力学研究提供了理论参考。而近年来,人组织激肽释放酶的药效研究主要集中在脑缺血及脑缺血再灌注、脑梗塞、心肌缺血再灌注等病症中的促进血管再生和减少神经细胞死亡等方面,这为将来蛇毒类激肽释放酶重点集中于研究促进血管再生、神经细胞发生以及改善微循环等药理药效的研究方向提供了参考依据,为进一步研究其药理药效作用奠定了基础。
6、 蛇毒类激肽释放酶研究的展望
蛇毒是一类天然的药用资源库,含有多种特异性的活性多肽和蛋白类物质。目前临床上有很多药物都是根据蛇毒活性成分的作用机制来进行设计和应用的,如 Cushman 和 Ondetti报道的降压药物卡托普利,根据巴西箭头毒蛇 Bothrops jararaca 蛇毒中一种活性多肽的降压机制而研制; 抗凝血剂 Integrilin,根据美国东南响尾蛇 Sistrurus miliarus barbouri 蛇毒的一种活性酶而研制,目前都已经广泛应用于临床治疗上。
还有一些正在进行临床研究的候选药物,如澳大利亚昆士兰大学的研究人员正在对来自 Australian elapidvenoms 蛇毒中的 3 个针对心脑血管疾病的候选药物:
Textilinin-1,Haempatch 和 CoVase 重点进行临床前应用研究,开发成功后将会为心脑血管疾病领域的治疗增加一类新药。由此可见,蛇毒中的活性成分都极其具有开发为临床治疗药物的潜能,为相关疾病的治疗带来新的希望。而目前关于蛇毒类激肽释放酶的研究主要集中在酶学性质和结构鉴定等方面,对药理、药效和药代性质的研究相对比较薄弱,这为蛇毒类激肽释放酶开发为新药提供了巨大的潜力和发展空间,为治疗心脑血管疾病带来新的治疗前景。
常规的分离纯化技术得到的蛇毒酶类纯度不高,且蛇毒酶类的性能会受到地域、气候、毒蛇养殖条件和不同批次蛇毒分离纯化条件的影响,使得酶制剂的性能不均一而影响蛇毒酶类深入的研究和发展。随着分子生物学的快速发展,利用基因工程技术将研究手段从蛋白质水平转向分子水平,通过克隆蛇毒酶类基因,转入表达载体进行表达,而随着对改进表达系统,产物蛋白复性、后修饰及对宿主毒性,提高表达量和生物活性等研究方面的深入,都使得利用基因工程手段表达制备具有活性的重组蛇毒酶类成为未来的研究方向,也是制备蛇毒类激肽释放酶的研究方向,这会使天然蛇毒资源和产品纯度的问题得到解决,为更深入地研究其药理药效作用机制提供丰富的物质来源。
随着分子生物学和基因工程等生物技术的飞速发展,相信蛇毒类激肽释放酶的研究会越来越深入,更能广泛地应用于基础研究并在临床医学上发挥重要治疗作用。