中成药口服给药制剂与其原料药检出污染微生物的关联

　　六味地黄丸、牛黄消炎片和西黄丸，由于处方中含有动物药( 人工牛黄、麝香、珍珠母、蟾酥) 、植物药( 熟地黄、酒萸肉、乳香、没药、山药、牡丹皮、大黄、茯苓、泽泻、青黛、天花粉) 和矿物药( 雄黄) ，且制法为以部分生药粉入药，所以均属于含药材原粉的中成药口服给药制剂。相对于化学药品，虽然中成药通过炮制、加工、提取等手段处理后其微生物种类和数量都有一定程度的下降，但仍具有微生物客观存在的事实，国外药典均收载了中药材( 饮片) 的微生物限度检查方法和标准，而中国药典尚未收载相关内容。据此，本文按照 2010 年版中国药典和 16 版日本药局方的微生物限度检查方法，对上述 3 种中成药及其主要原料药( 珍珠母、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、没药) 进行微生物限度检查，并将从样品中检出污染微生物进行菌株鉴定分析，探讨中成药口服给药制剂与其原料药检出污染微生物之间的相关性，为中成药和中药材( 饮片) 的微生物限度标准合理化和产品质量提高，提供参考依据。

　　1 仪器与材料

　　生物安全柜( 美国 Thermo 公司) ，生化培养箱( 德国 Binder 公司) ，Phoenix 100 型全自动细菌鉴定试验系统( 美国 BD 公司) ，Crystal Spec 型比浊仪( 美国 BD 公司) 。

　　六味地黄丸: 144 批( 30、36、54、60、72 g·瓶－ 1，6 g·袋－ 1，9 g·丸－ 1) ，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂、广州白云山和记黄埔中药有限公司、贵州百灵企业集团制药有限公司、哈药集团世一堂制药厂等 54 个药厂。

　　牛黄消炎片: 114 批( 0. 05g·片－ 1) ，长春海外制药集团有限公司、大连辉仁制药有限公司、多多药业有限公司、抚顺澎健药业有限公司、哈尔滨华雨制药集团有限公司、哈药集团世一堂制药厂、河北永丰药业有限公司、黑龙江葵花药业股份有限公司、吉林省辉南天宇药业股份有限公司、金昌金丹药业有限公司、山东仙河药业有限公司、上海皇象铁力蓝天制药有限公司、烟台天正药业有限公司、药都制药集团股份有限公司。

　　西黄丸: 67 批( 3g·瓶－ 1) ，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂、本溪仙草堂药业有限公司、吉林济邦药业有限公司、济南宏济堂制药有限责任公司、九寨沟天然药业集团有限责任公司、辽宁华鑫药业有限公司、辽宁仙鹤制药有限责任公司、四川康定金珠制药有限责任公司、天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂、通化金马药业集团股份有限公司、通化玉圣药业股份有限公司、武汉健民大鹏药业有限公司、浙江天一堂药业有限公司。

　　原料药: 珍珠母( 205042) 、熟地黄( 204211) 、酒山茱 萸 ( 301161 ) 、牡 丹 皮 ( 303091 ) 、醋 没 药( 208071) ，( 500 g·袋－ 1) ，北京华邈中药工程技术开发公司。

　　培养基: 胆盐乳糖增菌液、玫瑰红钠琼脂、营养琼脂、营养肉汤、改良马丁、改良马丁琼脂、胰酪胨大豆琼脂培养基 ( 批号分别为 1009162、1007052、1103092、100628、090903、090925、120730，北京三药科技开发有限公司，灵敏度实验符合 2010 年版中国药典规定) 。

　　枯草 芽 孢 杆 菌 ( Bacillus subtilis) ［CMCC －B63501］、金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus)［CMCC － B 26003］、大肠埃希菌( Escherichia coli)［CMCC － B 44102］、白色念珠菌( Candida albicans)［CMCC － F 98001］，中国医学细菌保藏中心; 黑曲霉( Aspergillus niger) ［CMCC － F 98003］，中国食品药品检定研究院。

　　试剂: 鉴定培养液、革兰氏阳性细菌鉴定/药敏板、革兰氏阴性细菌鉴定/药敏板 ( 批号分别为2107002、2046476、2088399，碧迪医疗器械上海有限公司)
　
　　2 方法

　　参照 2010 年版中国药典一部微生物限度检查法进行实验，简述如下。

　　2. 1 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30 ～ 35 ℃ 培养 18 ～ 24 h; 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23 ～28 ℃ 培养 24 ～ 48 h。上述培养物用 0. 9% 的无菌氯化钠溶液制成每1 mL 含菌数为50 ～100 cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，23 ～28 ℃培养5 ～7 d，加入0. 9%的无菌氯化钠溶液 3 ～5 mL，将孢子洗脱。吸出孢子悬液至无菌试管内，用 0. 9%的无菌氯化钠溶液制成每 1 mL含孢子数为 50 ～100 cfu 的孢子悬液。

　　2. 2 供试液制备 称样品 10 g，加 pH 7. 0 无菌氯化钠 － 蛋白胨缓冲液至 100 mL，用匀浆仪混匀或摇匀，得 1∶ 10 供试液，备用。

　　2. 3 细菌、霉菌和酵母菌计数检查验证试验 培养基稀释法: 取不同量的供试液( 1∶ 10) 入皿，加入验证菌，然后每皿加营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基约 20 mL，摇匀，即培养基稀释。如 1 mL·皿－ 1为1∶ 200 稀释，0. 5 mL·皿－ 1为 1∶ 400 稀释。细菌置35 ℃ 培养; 霉菌和酵母菌置 25 ℃ 培养，观察结果。

　　2. 4 细菌、霉菌和酵母菌计数检查试验 培养基稀释法: 为保证样品中污染微生物计数的准确性，取不同量的供试液( 1∶ 10) 、( 1∶ 100) 入皿，然后每皿加营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基约 20 mL，摇匀。细菌置35 ℃培养; 霉菌和酵母菌置25 ℃培养，观察结果。

　　2. 5 污染菌株分析 使用无菌棉签挑取从六味地黄丸、牛黄消炎片和西黄丸及其原料药中分离的污染菌落至鉴定培养液中，混匀，使用比浊仪调节菌液浓度在0. 5 ～0. 6 McF 范围内。将菌液倒入药敏板，将药敏板放入全自动细菌鉴定试验系统进行菌株分析。

　　3 结果与讨论

　　3. 1 微生物限度检查法的建立 采用培养基稀释法检查六味地黄丸、牛黄消炎片和西黄丸时，样品经1: 200 稀释后对筛选菌株枯草芽孢杆菌的平均回收率为 92%、89%、90%，在此条件下，用其余 4 株验证菌株进一步验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉以及白色念珠菌的平均回收率，结果见表 1。

　　采用上述方法检查珍珠母、熟地黄、酒山茱萸、牡丹皮、醋没药时，样品对筛选菌株枯草芽孢杆菌的平均回收率为 96%、94%、89%、90%、96%、，在此条件下，用其余 4 株验证菌株进一步验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉以及白色念珠菌的平均回收率，结果见表 2。【表1-2】


　　
　　3. 2 六味地黄丸、牛黄消炎片和西黄丸及其原料药的微生物限度检查结果 六味地黄丸的细菌数检查结果，＜10 cfu·g－ 1为39 批; 10 ～100 cfu·g－ 1为63批; 100 ～500 cfu·g－ 1为 22 批; 500 ～1000 cfu·g－ 1为 11 批; 1000 ～5000 cfu·g－ 1为 6 批; 5000 ～10000cfu·g－ 1为 3 批。霉菌和酵母菌数检测结果，均为＜ 10 cfu·g－ 1。

　　牛黄消炎片的细菌数检查结果，＜10 cfu·g－ 1的有24 批;10 ～100 cfu·g－ 1的有19 批;100 ～500 cfu·g－ 1的有21 批; 500 ～1000 cfu·g－ 1的有 6 批; 1000 ～5000 cfu·g－ 1的有 28 批; 5000 ～10000 cfu·g－ 1的有16 批。霉菌和酵母菌数检测结果，均 ＜ 10 cfu·g－ 1。

　　西黄丸的细菌数检查结果，＜ 10 cfu·g－ 1的有45 批; 10 ～ 100 cfu·g－ 1的有 5 批; 100 ～ 500 cfu·g－ 1的有 6 批; 500 ～1000 cfu·g－ 1的有 2 批; 1000 ～5000 cfu·g－ 1的有 5 批; 5000 ～10000 cfu·g－ 1的有4 批。霉菌和酵母菌数检测结果，均 ＜ 10 cfu·g－ 1。

　　所有批次的检品中，六味地黄丸、牛黄消炎片和西黄丸的细菌数检测结果，＜10 cfu·g－1的有108 批;10 ～1000 cfu·g－1的有154 批;1000 ～10000 cfu·g－ 1的有 62批; 霉菌和酵母菌数检测结果，均为 ＜10 cfu·g－ 1。

　　其主要原料药的 3 次细菌数检查平均结果分别为: 珍珠母 7800 cfu·g－ 1; 熟地黄 670 cfu·g－ 1; 酒山茱萸 290 cfu·g－ 1; 牡丹皮 3600 cfu·g－ 1; 醋没药6700 cfu·g－ 1。3 次霉菌和酵母菌数检测结果均为＜ 10 cfu·g－ 1。

　　3. 3 污染菌株鉴定结果 对从六味地黄丸、牛黄消炎片和西黄丸中检出的污染菌进行菌株分析。检出枯草芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、短芽孢杆菌、斯润金芽胞杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌、少动鞘氨醇杆菌、糖原甲基菌、成团泛菌、非脱羧勒克氏菌、弗氏志贺氏菌、溶黄嘌呤厄氏菌、伤口埃希氏菌、莫拉氏菌、金氏金氏菌、路邓葡萄球菌、人葡萄球菌、克氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌臭鼻亚种、假单胞菌某些种、科氏葡萄球菌科氏亚种、西地西菌 EO －2 群，共计 31 株污染菌。

　　从珍珠母、熟地黄、酒山茱萸、牡丹皮、醋没药中检出金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、环状芽孢杆菌、鸡葡萄球菌、矮小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、松鼠葡萄球菌、凝固芽孢杆菌、短芽孢杆菌，共计 13 株污染菌。

　　近年来随着大量抗生素和免疫抑制剂的广泛应用，许多传统上不致病或无毒性的微生物越来越多地成为人体感染的主力军。例如: 金黄色葡萄球菌、假单胞菌、芽孢杆菌、微小杆菌等均会在人体基础病变引起机体防卫功能降低时导致各种机会感染。所以，虽然上述污染菌株多为环境常见菌，没有危害性较大的致病菌，但也属于条件致病菌，其用药对象若是婴幼儿及衰弱患者，就会导致使用该药品的患者受到感染。

　　4 讨论

　　药品卫生标准是保证药品质量的重要因素，从上述菌株鉴定结果可知，六味地黄丸、牛黄消炎片和西黄丸与其主要原料药中检出的污染微生物均有重复出现，其中绝大部分为芽孢杆菌，因此从上述 3 种中成药中分离得到的污染菌，很可能来自其生产所用的原料( 中药材和饮品) 。中药材和饮品因含有大量的有机质，在生长、储藏、加工过程中易受各种微生物的污染，尤其极易受到芽孢杆菌属的污染，直接影响制剂成品的质量，例如: 芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌主要来源于土壤。而且，中成药口服给药制剂多源于天然植物、动物和矿物，其生产工艺特殊，虽然通过炮制、加工、提取等手段处理后其微生物种类和数量都有一定程度的下降，但相对于化学药品，仍具有微生物客观存在的事实。所以，如果不重视中成药口服给药制剂生产过程的微生物控制，就会增加诱发其微生物污染因素，部分污染菌在产品的灭菌、烘干等加工过程中还会形成可以抵抗物理和化学屏障的生物膜，甚至变异为传统生理生化方法无法检出的条件致病菌。因此要意识到成品控制满足不了产品污染微生物的控制，需要结合更多生产过程控制保证产品质量，例如: 将污染菌株的分离、鉴定与分析作为中成药口服给药制剂及其原料药质量标准的重要组成部分，进一步开展生产过程与微生物限度检查结果相关性的研究，以减少中成药生产各工序环节中诱发药品微生物污染因素。
　　
　　此外，中成药生产企业应彻底改变传统的生产面貌，例如，采用标准厂房、标准取样室和标准净化实验室，生产上形成机械化、管道化、连续化的制剂和包装工序的生产线，将所用药材按规定进行拣选、整理、洗涤等前处理加工，生产过程控制在不同洁净级别的厂房内，就能把微生物的含量控制在一定范围内，并辅以适宜的灭菌方法，就能保证药品的卫生质量，例如: 含原生药粉的丸剂，国家规定的微生物限度为不超过 30000cfu·g－ 1，若前处理后微生物含量为 200000 cfu·g－ 1，用6 kGy 辐照的辐照剂量，把微生物降低 89% ～97% ( 即为 6000 ～ 22000 cfu·g－ 1) ，就能符合微生物控制标准。同时，还可将计算机用于生产过程控制和管理，采用先进的检测仪器，例如: 利用水活度检测技术，控制中成药微生物生长和产品质量的关键控制指标。并建议适当改变国家药典的中成药口服制剂质控标准，例如，参考国外中成药质控标准，增加中成药的控制菌检查种类。

　　这样，将才有助于中药的健康发展，最终使我国中成药生产企业能够参与国际药品贸易竞争和中药产品的国际贸易签证体制。

　　参考文献
　　
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