多重链接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）最早是由荷兰的Schouten博士于2002年发明的，是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行检测和分析的新技术[1].该技术仅需20 ng/μL模板DNA或RNA,即可通过简单的探针杂交、连接及PCR扩增和电泳步骤，在同一反应管中对多达50个不同的靶基因进行检测和分析。该技术经过短短几年的发展，目前已经在遗传疾病、基因甲基化分析等多个领域中得到了广泛应用[2-3].
1MLPA的原理
MLPA技术是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而实现多对靶分子的高效特异性分析。其核心技术是设计与目的靶序列高度特异性的长探针和短探针，发生MLPA反应时，这两段探针首先分别与模板序列杂交，之后通过连接酶将两段探针进行连接。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。长探针和短探针发生连接后，生成一条两端分别含有上下游通用PCR引物的全长探针，并在通用引物的扩增之下，使模板成链式放大，最后生成的PCR扩增产物通过毛细管电泳分离，再经软件分析[1].
2MLPA反应步骤
2.1 探针与靶序列杂交
在MLPA反应中，一个目标序列需要设计一对探针，包括长探针和短探针，短探针由两段核苷酸组成，包括位于5‘端的PCR通用正向引物序列和位于3’端的模板特异性序列；长探针由三段核苷酸组成，包括位于5‘端的模板特异性序列和3’端的通用反向引物序列外，在两者之间还添加了大小不等的填充序列（指纹序列），填充序列不是必须的，主要是用于区分扩增产物的大小。MLPA反应时，首先将双链DNA在98℃变性裂解，裂解为单链DNA,温度降为60℃时长短探针分别与单链DNA过夜杂交[1-3].
2.2 探针的特异性连接
调节温度降为54℃，加入连接酶。如果被检核酸中含有靶序列，则长短探针可均与模板序列互补良好，连接反应可以进行，长短探针可以连接为一条完整的核酸单链。若其中一条探针的序列与被检靶基因序列不完全互补，即使只有一个碱基不互补，也会使杂交不完全而使连接反应无法进行。这种连接是高度特异性的，保障了MLPA的高特异性优势[1-4].
2.3PCR扩增
MLPA扩增的并不是被检样本核酸，而是上述连接生成的与靶序列结合的完整核酸探针，只要有一条完整的核酸单链生成了，PCR扩增反应即可进行，这保证了MLPA技术的高灵敏性。连接反应完成后，每一条完整的核酸单链5‘端都带有通用PCR正向引物，3’端都带有通用PCR反向引物。由于事先给每种被检基因的长探针加入了特定大小的指纹序列，每对探针的扩增产物的长度都是唯一的，在通用引物的扩增下，这些大小不同的扩增片段被同时扩增了出来，一般相邻两产物的长度差可以在10 bp之间，这样可以同时检测的基因数可高达50种不同靶基因[1-4].
2.4 毛细管电泳分析
PCR扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳分离分析，也可通过毛细管电泳等进行分离分析。但一般情况下由于多重扩增的不同片段之间相差较小，而且，扩增片段大小多集中于90~150之间效果较好，普通琼脂糖凝胶电泳无法分离，建议使用毛细管电泳，再用相关软件分析电泳结果[2,4].
3MLPA的优缺点
MLPA作为一种新型检测技术，具有如下优点：1.灵敏度高，所需样本量小，最少仅需20 ngDNA即可完成检测，检测限可达3 000~6 000个靶分子；2.多重分析，可同时检测多达50检测靶基因；3.特异性强，检测精准度高，可以区分单个核苷酸不同，保证了检测的特异性；4.高通量，一个反应可以同时检测多种病原，有利于疫病的及时确诊；5.自动化程度高，在PCR结束之后直接可用毛细管电泳分析结果，操作易于标准化；6.一次检测可完成96个样品的检测[1-2].
MLPA技术尽管有诸多优点，但其毕竟是一种新技术，局限性特别是应用方面的局限性是难免的：1.目前普及程度不高，试剂比较昂贵；2.探针设计比较困难耗时，不过一旦前期设计完成，后期的高通量检测工作即容易进行；3.由于需核酸杂交，操作比较繁琐而且费时；4.应用受限制，目前更多的应用还是基因突变和甲基化检测，在其他领域进展缓慢。
4MLPA的应用
4.1 用于检测人类基因或基因片段的缺失或重复
人类很多遗传性疾病都跟基因缺失或突变有关，因此MLPA多年来在基因遗传性疾病的研究及临床监测中发挥了巨大应用。如MLPA技术已用于遗传性非息肉性结直肠癌的鉴别以及卵巢癌和乳腺癌患者的预后等，也可用于多种遗传病的基因定量研究，如苯丙酮尿症，杰格斯综合征及多发性神经纤维瘤等[5].
4.2 用于检测由染色体异常引发的疾病
染色体重排常引发智力发育迟缓及其他多种神经系统疾病。MLPA可以检测出染色体重排或微小重排。已有多家实验室对MLPA技术在检测精神发育和神经系统疾病中的应用进行研究，已报道的有Williams综合征、Sotos综合征及Axenfeld-Rieger综合征等[3].MLPA可以识别单个核苷酸的差异，因此可用于单核苷酸多态性和各种点突变的检测。MLPA技术也可以检测染色体数目的异常，如唐氏综合征等。
4.3MLPA在肿瘤检测方面的应用
大约30%的人类肿瘤基因组中存在DNA拷贝数异常，其中DNA拷贝数增加是癌基因激活的重要方式。由于MLPA技术可检测出DNA拷贝数量的异常，因此已被应用于多种肿瘤的检测中。2003年，Eldering等[6]在MLPA技术基础上建立了逆转录-MLPA（RT-MLPA），该技术改进能够发现m RNA低拷贝数变异。此外，细胞全基因组水平的低甲基化和局部区域关键基因的高甲基化也是肿瘤的基本特征，且其甲基化状态的改变往往出现于细胞恶性增生早期，并随恶性肿瘤的发生、发展而变化。因此，检测细胞甲基化状态对肿瘤的预防、治疗及观察预后都有极其重大的意义。甲基化特异性MLPA（methylation-specific MLPA,MS-MLPA）是一种由MLPA技术部分改进而成的可检测基因甲基化情况的新技术[1,7],可以实现此目的。
4.4 用于传染病的高通量检测
MLPA被报道以来主要用于基因遗传病的检测，近些年逐渐发展到传染病高通量检测，表现出了良好的发展势头。Martin等人建立了可以同时检测15种呼吸道病毒的MLPA方法，敏感性与单个荧光PCR相当，但检测通量大大提高了[8].Muvunyi等建立了MLPA同步检测7种性传播疾病，结果用单重荧光PCR验证，符合性达到100%[9].Lina等利用MLPA技术，建立了可以同时检测10种蜜蜂病毒的高通量筛选技术，取得了较好效果[10].国内史喜菊等人前期研究建立了五种猪病MLPA同步检测技术[2],在此基础上，又建立了五种牛病MLPA同步检测技术[4],后期这两种检测技术可以完全融合，实现10种动物疫病的MLPA同步检测平台，而且该平台是开放式的，后期可以随时加入更多的病原菌。Ehlert等利用了MLPA技术建立了同时检测10种食品过敏原的高通量技术[11].
这些研究都表明，MLPA技术为疫病的多重检测提供了一种全新的检测技术平台，可用于国内动物疫病疫情的检测、监测和普查以及相关病原疫苗、检测试剂病原纯度的检测，也可用于动物源性食品相关病原的检测。
参考文献：
[1] Schouten J P,Mc Elgunn C J,Waaijer R,et al. Relativequantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex liga-tion-dependent probe amplification[J].Nucleic Acids Research,2002,30（12）：1-13.
[2] 史喜菊，马贵平，乔彩霞，等。 多重链接探针扩增技术同时检测五种猪病的研究[J]. 农业生物技术学报，2013,21（6）：745-752.
[3] 韩瀚，刘敬忠，王清涛。 多重连接探针扩增技术的研究进展及其应用[J]. 诊断学理论与实践，2007,6（4）：380-383.
[4] 史喜菊，马贵平，柏亚铎，等。 五种牛病多重链接探针扩增同步检测方法的建立[J]. 农业生物技术学报，2015.
[5] 张宏，盛剑秋，耿洪刚，等。 多重连接依赖的探针扩增技术检测中国人遗传性非息肉病性结直肠癌错配修复基因大片段缺失[J]. 中国医学科学院学报，2006,28（6）：837- 839.
[6] Eldering E,Spek C A,Aberson H L,et al. Expression profil-ing via novel multiplex assay allows rapid assessment of generegulation in defined signalling pathways[J]. Nucleic AcidsRes,2003,31（23）：e153.
[7] Nygren A O,Ameziane N,Duarte H M,et al. Methylationspecific MLPA （MS-MLPA）：simultaneous detection of Cp Gmethylation and copy number changes of up to 40 sequences[J].Nucleic Acids Res,2005,33（14）：e128.
[8] Reijans M,Dingemans G,Klaassen C H,et al. Respi Finder:a new multiparameter test to differentially identify fifteen re-spiratory viruses[J]. Journal of Clinical Microbiology,46（4）：1232-1240.
[9] Muvunyi C M,Dhont N,Verhelst R,et al. Evaluation of anew multiplex polymerase chain reaction assay STDFinder forthe simultaneous detection of 7 sexually transmitted diseasepathogens[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2011 Sep,71（1）：29-37.
[10] Lina De Smet,Jorgen Ravoet,Joachim R,et al. A versa-tile MLPA-based diagnostic tool for screening bee viruses[J].PLo S One,2012,7（10）： e47953. Doi:10.1371/journal.pone.0047953. Epub 2012 Oct 29.
[11] Ehlert A,Demmel A,Hupfer C,et al. Simultaneous de-tection of DNA from 10 food allergens by ligation-dependentprobe amplification[J]. Food Additive Contamination Part AChemical Analysis Control Expoort Risk Assessment,2009,26（4）：409-418.
