植物物种鉴别中核基因条形码技术应用

植物生物技术论文第六篇：植物物种鉴别中核基因条形码技术应用

 

　　摘要：DNA条形码是利用一个或几个短的标准DNA片段，对物种进行快速准确鉴定的一种分子标记技术。核基因条形码序列具有进化速率快，长度保守，进化一致等优点，被广泛应用于植物分类、进化及亲缘关系分析等方面研究。单拷贝核基因序列进化速率中等，可以直接区分直系同源和旁系同源，没有内部重复，也没有明显的核苷酸偏向性，在研究植物分类和进化方面表现出较大优势，主要被用于物种间的亲缘关系及演变史、多倍体植物物种形成及系统关系分析、多倍体物种基因谱系的来源分析、多倍体物种的基因渗入现象等；多拷贝核基因序列在一些植物物种中可能与物种的早期分化联系更为紧密，较叶绿体DNA条形码更便于区分近缘物种，被广泛应用于被子植物科内、属内、属间关系系统发育研究，并用于药用植物及混伪品的鉴别分析。本综述主要概括总结了单拷贝核基因、多拷贝核基因ITS和ITS2序列在植物中的研究进展，探讨了核基因条形码目前研究存在的问题，并对今后的发展前景进行了展望。

 

　　关键词：核基因条形码; 物种鉴定; 单拷贝核基因; ITS;

 

　　Research Progress of Nuclear Gene Barcodes Identification Technology in Plants

 

　　Bi Yufang Cai Hanjiang Pan Yanhong Wen Xing Wang Anke

 

　　Key Laboratory of State Forestry Administration on Bamboo Resources and Utilization,China National Bamboo Research Center

 

　　Abstract：DNA barcoding is a molecular marker technique through the use of one or several short standard DNA fragments to quickly and accurately identify species. Nuclear gene barcoding sequences have the advantages of rapid evolution, conservative length and uniform evolution, and are widely used in plant classification, evolution and genetic relationship analysis. The single-copy nuclear gene sequence has a moderate evolutionary rate, which can directly distinguish direct homology and para-homology, without internal duplication or obvious nucleotide bias,showing great advantages in studying plant classification and evolution, which is mainly used for the analysis of genetic relationship and evolution between species, polyploid plant speciation and the analysis of systematic relationship, polyploid species genetic pedigree analysis, polyploid species gene infiltration phenomenon and so on. The multicopy nuclear gene sequences may be more closely related to the early differentiation of species in some plant species, are more convenient to distinguish related species than chloroplast DNA barcodes, which are widely used in the phylogenetic studies of intra-family, intra-genera and inter-genera relationships in angiosperms, and also for the identification and analysis of medicinal plants and adulterated products. In this paper, the research progress of single-copy nuclear genes, multi-copy nuclear genes ITS and ITS2 sequences in plants was reviewed, the existing problems in the research of nuclear gene barcode were discussed, and the future development prospects were prospected.

 

　　DNA条形码是利用基因组中一段或几段短的标准DNA片段进行物种识别和鉴定的技术(Hebert et al.,2003;Kress et al.,2005)。可以解决形态分类极易混淆的难题，识别难以区分的隐秘种，而且可对非完整的生物标本进行鉴定，是传统形态分类与物种鉴定的强有力补充(罗亚皇等,2013)。

 

　　目前，叶绿体基因组的rbc L、mat K、trn H-psb A和核基因组的ITS片段被推荐作为多数高等植物的DNA条形码(Kress and Erickson,2007;CBOL Plant Working Group,2009;China Plant BOL Group,2011)。但由于叶绿体基因组进化较慢，约为核基因组进化速率的一半，开发出来的DNA条形码鉴定率相对较低，从而限制其在较低分类阶元(如属,亚属)中的应用(Wolfe et al.,1987)。单拷贝核基因序列进化速率中等，可以直接区分直系同源和旁系同源，没有内部重复，也没有明显的核苷酸偏向性，在研究植物分类和进化方面表现出较大优势(杨晨阳等,2018)；多拷贝核基因序列如ITS、ITS2等在一些植物物种中可能与物种的早期分化联系更为紧密，较叶绿体DNA条形码更能有效区分近缘物种(China Plant BOL Group,2011;Wang et al.,2011)。本综述主要对单拷贝核基因、多拷贝核基因ITS和ITS2序列的研究进行概述，以期对核基因序列在植物中的物种鉴定和系统发育学研究提供理论参考。

 

　　1 单拷贝核基因序列在植物中的应用

 

　　1.1 亲缘关系及系统发育分析

 

　　单拷贝核基因(single copy nuclear gene,scnDNA)是指基因组中拷贝数只有1个或几个拷贝的核基因，大多数属于管家基因。单拷贝核基因属于双亲遗传并能提供大量信息位点，并具有直系同源、易于扩增测序等优点，只在物种分化时才发生分离，可以更好反映物种的进化史。越来越多的研究发现，单拷贝核基因可以更加高效的用于植物的分子系统学分析。目前单拷贝核基因序列主要被用于物种间的亲缘关系及演变史、多倍体植物物种形成及系统关系分析、多倍体物种基因谱系的来源分析、多倍体物种的基因渗入现象等。

 

　　单拷贝基因由于不存在多拷贝，变异信息丰富，具有更高的测序成功率，在探讨物种间的亲缘关系和系统发育分析上具有较大优势。Michael等(2001,第九届国际苏铁生物学大会,pp.21)通过测定Cy-AG-AM(CycasAgamous)、PEX4、PMP22和ATG2等4个单拷贝核基因的分子序列，分析泽米铁属植物之间的亲缘关系，并利用生物地理学和宏观形态学比较的方法讨论了基于上述基因片段建立的泽米属的主要支系和新建立的亲缘关系。Joly等(2006)开发了单拷贝基因GAPDH作为蔷薇属植物的核基因标记。Duarte等(2010)发现杨属、拟南芥属、葡萄属和稻属4个属植物之间共享的959个单拷贝核基因。这些单拷贝基因也被应用于杨柳科(Du et al.,2014)、山龙眼科(Tonnabel et al.,2014)等多种植物的系统关系研究中，为单拷贝核基因DNA条形码的筛选提供了依据。Lu等(2014)利用LFY和NLY两个单拷贝核基因，重建了裸子植物的系统发育过程，结果表明LFY和NLY序列可以用来分析裸子植物的科间系统发育关系和属间亲缘关系。王凡红(2014)选取了3个单拷贝核基因(IBR3＿2,DETl和SQD1＿1)进行试验，其中IB-R3＿2基因的PCR扩增率接近100%，但测序成功率不理想，目前仅在鞭叶铁线蕨系进行了后续分析。赵奉彬(2016)对中国杨属17个代表种69个样本选取核基因组单拷贝片段DSH10、DSH28进行DNA条形码研究，分析结果表明单拷贝核基因DSH10和DSH28的物种区分能力较好，效果明显优于叶绿体片段，证明核基因片段对于鉴定杨属物种更为适合。李建芳等(2017)发现单拷贝核基因RR255与R257可用作地黄专用鉴定条形码。杨晨阳等(2018)以利用单拷贝核基因GAPDH对蔷薇属植物的遗传多样性进行分析，构建了基于GAPDH基因的系统发育树，结果表明基于GAPDH基因的分类结果与现有蔷薇属分类结果有较大差异，如芹叶组和桂味组并未形成单系类群，可能与基因交流有关。单拷贝基因在分析植物亲缘关系和探讨系统发育上具有良好效果，但是部分植物的分子分类结果与传统形态分类结果显现出较大差别，分析发现可能是在物种间基因进行了重新组合的缘故。

 

　　1.2 物种起源和系统演化

 

　　在揭示物种起源、重建杂交物种形成过程时，叶绿体基因为单亲遗传，无法为杂交起源提供依据，多拷贝核基因由于协同进化等原因，可能提供不可靠信息，而单拷贝基因由于不存在协同进化，具有父母双方的遗传信息，在揭示物种起源上具有不可取代的作用。Wang等(2014)利用24个单拷贝核基因序列，分析了杨树的系统发育关系，推测了杨树杂种的起源。唐政(2014)利用9个单拷贝核基因(SCNGs)，对27份柑橘属及其近缘种的演化进行研究，揭示了柑橘属及其近缘种的亲缘关系和演变历史，为进一步利用单拷贝基因分析研究柑橘属系统演化提供帮助。董山平(2015)克隆测序获得单拷贝核基因Leafy、RPB2等序列，并构建系统发育树，分析榆叶梅与其它近缘种的亲缘关系，研究发现矮扁桃、榆叶梅、长柄扁桃为一个类群，‘紫烟’榆叶梅可能为杂交起源，其父母本可能一方来自榆叶梅，另一方来自山桃或中国李或其它近缘种。单拷贝基因在研究物种起源进化上提供了重要依据，利用单拷贝基因分析植物与近缘种的亲缘关系及演变历史、揭示杂种起源，将为系统演化提供理论依据。

 

　　1.3 物种界定及遗传变异分析

 

　　传统的物种界定主要依赖于形态特征，但杂交给物种界定带来了巨大困难，传统分子标记仅仅从基因频率角度进行聚类分析，往往忽略了建树分析，而由于物种杂交，导致叶绿体基因在种间共享，造成其在物种界定分析中的失败，单拷贝核基因基因组中只有一个成员，且直系同源，在物种界定和遗传变异分析方面起到了重要作用。余双炳(2015)利用单拷贝核Pgk1基因探讨东亚、中亚以及青藏高原、欧洲4个冰草(A.cristatum)居群对不同环境所发生的进化；基于Nei's的基因分化系数表明居群内变异是冰草物种的主要变异来源。并结合地质历史事件，分析了其进化成因。杜淑辉等(2016)对4个欧洲山杨自然居群72个个体的6个单拷贝核基因标记(sing-copy nuclear markers)进行扩增与测序，并进行生物信息学分析，研究中国新疆地区欧洲山杨自然居群的遗传多样性与遗传分化水平。遗传多样性指数为0.73，表明欧洲山杨表现出较高的遗传多样性水平；AMOVA分析表明山杨居群间表现出较低的遗传分化水平，遗传变异主要存在于居群内。陈君(2017)发现可利用在白栎组(Section quercus)中开发的19个单拷贝核基因序列，进行白栎组系统发育关系研究，并可以对白栎组进行较好的物种界定。结果表明白栎组物种以南北为界限分为两支。除枹栎外节点的后验概率都不高，可能原因是共享祖先多态或基因渐渗的结果。单拷贝核基因由于可以直接区分直系同源和旁系同源，进化速率更快，序列更为丰富，目前在植物亲缘关系分析、物种进化、多倍体物种来源分析等方面取得了良好进展，但由于多数植物的基因组信息不够丰富，单拷贝核基因还不能作为通用的DNA条形码序列，随着基因组新一代测序的发展，越来越多的单拷贝将被挖掘出来，将为单拷贝核基因的筛选提供有效依据。

 

　　2 ITS序列在植物系统发育和混伪品鉴定中的分析

 

　　2.1 属间关系系统发育分析

 

　　ITS即nrDNA的内转录间隔区，为rDNA基因中5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔序列，具有序列高度变异性、长度保守性、一致进化、进化速率快等优点，可提供详尽的、系统学分析所需的可遗传性状，主要被广泛应用于被子植物科内、属内、属间关系系统发育，以及一些混伪品的鉴定研究(Powerse et al.,1997)。

 

　　ITS序列由5.8S、ITS1和ITS2组成，进化速度较快，被广泛应用于植物属间的系统发育分析，揭示植物与其近缘属之间的亲缘关系。Hodkinson等(2000)运用ITS序列和AFLP标记结合的方法对比研究了刚竹属、方竹属、倭竹属、唐竹属、新小竹属35个竹种的系统发育关系。Guo等(2001)以高山竹筱竹属复合群及其近缘属箭竹、玉山竹属和悬竹属等不同类群为材料，利用ITS核糖体DNA内转录间隔区序列分析了ITS序列在界定竹类植物属间的可靠性。姚娜等(2014)对8个牧草物种共22个品种进行ITS扩增并测序。ITS的扩增成功率和物种鉴定成功率均达到100%，同源性分析表明物种间变异位点多、变异显著，表明ITS序列可以作为鉴定牧草的DNA条形码。成宇等(2018)对贵州省19科26属30种林木树种植物ITS序列进行PCR扩增及测序，并计算了种内、种间遗传距离，构建了系统发育树。结果得出ITS序列对30种林木树种的鉴定成功率为83%,ITS序列可作为林木树种DNA条形码的候选序列。王苗苗等(2018)利用ITS序列对竹亚科13个属76个竹种进行DNA条形码分子鉴定，分析结果显示，种内遗传距离远小于种间遗传距离，ITS序列可用于竹类资源的物种鉴定研究。在以上植物属间关系研究中，ITS序列均达到了较高的扩增成功率和物种鉴定效率，种内遗传距离小、种间遗传距离大、变异位点多、变异显著，较好地揭示了植物属间的亲缘关系。

 

　　2.2 属内关系系统发育研究

 

　　ITS序列由于在植物较低分类阶元上核苷酸序列的长度保守和高度变异，可提供的遗传性状较为详尽，在分析属内亲缘关系上也应用颇多。Li等(2012)以国产63种榕属植物为研究对象，分析DNA条形码在榕属植物中的的鉴定效果。研究表明，ITS片段可以成功地分辨出其中45种，物种分辨率达75%。付涛等(2015)采用ITS序列对11株野生樱属植物进行分子鉴定，分析得出ITS种间变异程度较大，可作为鉴定樱属植物的标准条形码。钟浩等(2016)利用核糖体基因(nrDNA)的内转录间隔区(ITS)序列对9个茶竿竹亚属竹种进行了分析，探讨了怀集县铁厘茶竿竹和白水茶竿竹与其它茶竿竹亚属竹种之间在分子水平上的差异以及它们的分类地位。付涛等(2018)以30种典型樱属植物为试验材料，对其ITS序列进行测序分析并构建系统发育树，研究结果进一步确定了ITS序列可以作为鉴定樱属植物的核心条形码序列。覃瑞等(2019)利用ITS序列分析，揭示了9种乌头属植物之间的亲缘关系。ITS序列在分析属内种间的亲缘关系上起到了良好的效果，通过测序分析和系统发育树构建，探讨了植物在分子水平上的差异及其分类地位，可为传统分类作强有力的补充。

 

　　2.3 与近缘植物的区分及混伪品的鉴定研究

 

　　ITS由于进化速度快，变异程度高等特点，也适用于与近缘种的区分和混伪品的鉴定研究。吴劲松等(2014)对41份白及属药用植物样品基因组DNA的nrDNA ITS进行扩增、测序及序列分析，比较物种种内种间的变异，并评价不同序列的鉴定能力。结果显示，白及属物种nrDNA ITS种间变异(0.022～0.106)明显大于种内变异(0～0.012),NJ树也能准确地区分4个物种。结果表明，nrDNA ITS序列可以准确鉴定白及属及其混伪品，是适合白及属药用植物的DNA条形码。杨丽莹等(2016)对来自不同产地的28份落葵薯及其近缘植物的核基因ITS序列进行PCR扩增并测序，ITS序列种内和种间距离在Barcoding gap检验中明显分离；NJ树表明ITS序列可区分落葵薯及其近缘植物。夏至等(2014)通过ITS序列扩增和分析，评价了其对黄芩及其同属近缘种(易混品)的鉴别能力。夏至等(2016)对地黄属物种的ITS序列扩增和测序，比较各序列在种内和种间变异，并用最近距离法、相似性搜索法、构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树等方法进行鉴定分析。ITS序列的种内变异均小于种间变异。在NJ树上，地黄的所有样品与茄叶地黄聚在一支，支持率为96%，表明ITS序列可用于鉴定中药材地黄与同属近缘种。

 

　　ITS在植物与其近缘种的区分上具有重要的鉴别意义，利用ITS序列可对植物及近缘种进行快速准确的鉴定；而ITS在药用植物及混伪品中的成功鉴别，也为药用植物鉴定提供了科学依据和理论基础。

 

　　在许多亲缘关系较为密切的植物中，其ITS序列长度接近，但有一定变异，所以ITS序列可以应用于植物较低阶元的亲缘关系研究和系统发育分析，ITS序列在属间关系、近缘种的亲缘关系分析、种下等级划分等方面研究取得了较大进展。但由于一些植物如裸子植物的ITS序列长度较长，给序列扩增和测序工作带来很大难度，在实际操作中主要选取ITS序列中较为保守的区域进行亲缘关系分析和鉴定研究。

 

　　3 ITS2序列的应用

 

　　3.1 用于科及属内植物的鉴定

 

　　作为nrDNA的内转录间隔区(ITS)序列的一部分，ITS2具有序列长度短，易于扩增等特点，且ITS2二级结构区分度较高，鉴定范围较广，在提高构建系统发育树的准确性方面起重要作用(费希同等,2014)。ITS2进化速度较快，核苷酸序列变异大，可用于科内、属内、属间等的鉴定，是药用植物鉴定混伪品的通用条形码，但主要为属以下水平提供丰富的变异位点和信息位点。

 

　　Chen等(2010)最早利用内转录间隔区(ITS2）对6 600份植物分析，开启了ITS2应用于植物鉴定研究的先河。研究得出ITS2序列具有较高的鉴定成功率，推断可以作为植物鉴定的标准DNA条形码序列。Pang等(2010)以蔷薇科96个属的893种植物中采集的1 410份样品为研究对象，对4个DNA条形码序列进行了扩增和序列分析，发现ITS2序列用于鉴别蔷薇科植物的效果最好。王晓明等(2012)利用通用引物对以9种中药鸡骨草的ITS和ITS2序列进行PCR扩增，遗传距离和建树结果均表明ITS2序列适合作为豆科植物的DNA条形码，可为豆科植物种间鉴别提供依据。宋炳轲等(2014)利用ITS2序列对60份大麻原植物进行PCR扩增，测序后进行序列分析。结果显示所有样本的ITS2扩增片段序列完全一致，表明ITS2序列不适合用于鉴定大麻属植物。俞超等(2014)从8个贝母属21个样品中提取了基因组DNA，进行了ITS2序列的PCR扩增和测序，测序结果表明ITS2序列鉴定成功率为100%，种内及种间遗传距离分别为0.000 5和0.046 8，且种内高度保守；系统发育树构建结果显示ITS2序列所构建的系统发育树准确度较高。表明ITS2序列可以用作鉴定贝母属植物的通用条形码序列。张忠廉等(2015)研究发现ITS2序列能准确鉴别千斤拔属药用植物，可用于千斤拔药材基原植物DNA条形码鉴定研究。张艳艳等(2016)对5种木瓜属药用植物的19个样本ITS2序列进行PCR扩增和测序，计算其种间、种内的Kimura 2-parameter(K2P)距离，及各序列变异位点并构建系统发育树，并预测ITS2二级结构。结果ITS2序列间存在明显差异，构建的系统发育树显示ITS2序列能很好地将5种植物区分，显示出单系性；5种植物的ITS2二级结构存在明显差异。表明ITS2序列可以有效鉴别5种木瓜属植物。利用ITS2序列对不同植物物种进行分析，根据序列的差异，并结合系统进化树的结果，可以清晰地推断出各物种之间亲缘关系的远近，从而达到良好的鉴别效果。但在大麻属植物鉴定中ITS2扩增片段序列完全一致，表明在大麻属植物中ITS2序列为高度保守，所以出现了鉴定失败的现象。

 

　　3.2 药用植物及混伪品的鉴别分析

 

　　ITS2用于鉴别药用植物及其混伪品具有良好的重复性和稳定性，被列为鉴别药用植物首选DNA条形码。石林春等(2014)利用ITS2条形码对天南星及其混伪品7种58份样品进行鉴定分析。结果表明异叶天南星、东北天南星和天南星3种基原的种内K2P距离均小于其种间K2P距离，在NJ树上天南星3种基原分别聚为独立的支。天南星3种基原与天南星混伪品聚为不同的支。表明ITS2可以作为鉴定天南星3种基原及其混伪品的DNA条形码。周建国等(2016)通过分析裂叶荆芥及其混伪品的ITS2条形码序列，用软件MEGA6.0对扩增获得的ITS2条形码序列进行相关数据分析，对裂叶荆芥及其混伪品间的种间序列差异进行分析比较，计算其种间、种内K2P遗传距离，并构建邻接树。裂叶荆芥ITS2序列高度保守，种内无变异位点。裂叶荆芥与其混伪品种间变异位点较多，种间K2P最小距离为0.017 5，大于其种内距离，NJ树显示可以将裂叶荆芥与其混伪品完全分开。结果表明ITS2序列可作为鉴别荆芥、荆芥穗及其混伪品的新方法，为荆芥的种质资源鉴定提供了新的技术手段。通过ITS2序列的遗传距离分析和聚类结果表明，ITS2序列可以快速鉴定药用植物及其混伪品，但想确定ITS2序列是否可在更大范围内通用，需要进一步扩大植物标本的采集范围和数量。

 

　　3.3 用于植物及其近缘种的鉴别分析

 

　　ITS2不仅是区别植物与混伪品的重要手段，还可以较为准确地分析植物与其近缘种之间的系统发育关系，对植物系统分类具有重要意义。为准确鉴定柴胡与大叶柴胡，于俊林等(2014)以48份柴胡、大叶柴胡药材为材料，扩增ITS2序列并进行测序，采用CodonCode Aligner、MEGA5.0等软件进行分析比对，基于K2P模型进行遗传距离分析，并构建系统发育树，结果显示柴胡与大叶柴胡种间最小K2P距离远大于柴胡种内最大K2P距离。NJ树显示大叶柴胡与柴胡的关系较远，可以明显区分开来。朱珣之和高婷(2014)利用ITS2序列来探讨其17种常见入侵植物与36种近缘物种中的鉴定能力。结果表明，ITS2序列在入侵物种及其近缘物种间存在明显的遗传差异，种内变异小于种间变异，在入侵植物与其近缘物种中鉴定成功率达95.5%。构建的NJ树可以很好地显示各不同入侵植物物种的聚类。此外，ITS2的二级结构也具有一定的系统学及分类学意义。因此，ITS2条形码序列能够作为入侵植物分子鉴定的有力工具，具有重要的应用价值。吕泽芳等(2015)利用ITS2条形码序列探讨其对木瓜及近缘物属植物鉴定的可行性。结果表明，ITS2条形码能够快速鉴定木瓜属及其近缘属植物。ITS2序列由于长度短、易扩增、具有较高的鉴定成功率等特点，被认为是鉴定药用植物及其混伪品的标准DNA条形码序列，而上述研究结果表明，ITS2序列在区分植物及其近缘种方面，也起到了重要作用，可以很好地将植物及其近缘种区分开来。

 

　　ITS2序列由于序列长度短，进化速率快，变异位点较多，在大多数植物的鉴定中具有良好效果，目前已经被认定为是鉴别药用植物的最佳序列。但由于ITS2属于多拷贝核基因，在PCR扩增中会存在偏好性等问题，导致鉴定结果不理想甚至失败，可以采用与其他DNA条形码序列相结合的方法，更好地完成植物亲缘关系及系统发育等研究。

 

　　4 展望

 

　　目前核基因条形码由于进化速度快，在植物进化、分类及物种鉴定等方面应用广泛，可以用于许多植物的分析鉴定，但也存在不少鉴定不理想或失败的情况。如由于目前大多数植物缺乏基因组信息，单拷贝核基因条形码的通用性较差(李建芳等,2017)。而多拷贝基因，由于PCR扩增的偏好性和致同进化不完全等，易导致系统发育关系的不确定性(胡兆锋等,2013)。同时，还缺少对更大样本量的研究来确定核基因条形码的鉴定效率。

 

　　随着新一代测序(Next generation sequencing)技术的迅猛发展，许多植物全基因组序列开始陆续测定完成，从大量的测序信息中大规模获取核基因序列，使得开发不同物种通用的核基因条形码成为可能。同时扩大标本植物的采集范围和数量，更加准确地确定核基因条形码的鉴定效率。叶绿体基因受选择的压力大，相对更加保守，采用叶绿体条形码和核基因条形码多片段相结合的方案，将更好地识别和鉴定物种。同时结合经典分类的研究结果，可以使得物种鉴定工作更加高效、准确，为植物的系统演化及分类研究提供重要依据。

 

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