生物技术论文
摘 要
主要探索了本实验室提供的产核酸酶 P1 桔青霉的种子液生长曲线，研究在何种发酵工艺下酶活能够达到更高。根据不同的单因素探索与对比，最终培养基组成成分（质量体积分数）为 :蔗糖 1.5% ,蛋白胨 0.6 % , 胰蛋白胨 0.05%, 磷酸氢二钾 0.05%,磷酸二氢钾 0.05%，0.08% 氯化钙，0.01%硫酸锌,0.01%硫酸镁，初始 p H6.4,菌种接种量 15%，28℃，培养 72h 达酶活最高值, 最高酶液酶活为 788 U/ml。在新发酵方案下酶活比初始的核酸酶P1 酶活有了 23.1%的增长，有望成为更适宜的发酵条件。
关键词： 桔青霉 核酸酶 P1 发酵 摇瓶 酶活。
Abstract
The growth curve of the nuclease P1, Penicillium citrinum, which was supplied by ourlaboratory, was mainly explored. According to different single factor exploration and comparison,the final components (mass fraction) are: Sucrose 1.5%, peptone 0.6%, tryptone 0.05%,hydrogen phosphate two potassium 0.05%, potassium dihydrogen phosphate 0.05%, 0.08%calcium chloride, 0.01% zinc sulfate, 0.01% Magnesium Sulfate，initial p H6.4, inoculation ofbacteria 15%, 28, and culture. 72h was the highest enzyme activity, and the highest enzymeactivity was 788U/ml. Under the new fermentation schedule, the enzyme activity increased by23.1% compared with the initial nuclease P1 enzyme activity,It is expected to be a newFermentation conditions.
Keywords: Penicillium citrinum; nuclease P1; fermentation ;shake flask ;enzymeactivity。
1．引言
1.1 、桔青霉。
核酸酶 P1 的生产工艺到现在可以总结为两种：桔青霉发酵产核酸酶 P1 和直接从麦芽根中提取目标产物，试验采纳了产核酸酶 P1 的霉菌来发酵,这种霉菌就是桔青霉。桔青霉的种属是半知菌类，串珠霉目的一属，表观与曲霉临近，多核多细胞是其菌丝的根本组成单元。青霉菌在平板上看下来，平板正面深绿色，背面灰白色菌，菌落的中央有白色成长为深灰绿色。菌丝体的组成为横隔的菌丝，一般情况下以产生分生孢子的方法来进行无性繁殖，当产生孢子时，多细胞的分生孢子梗会在菌丝体顶端出现，梗的顶端分枝两三次，成串的分生孢子会分裂在每枝的末端细胞[16]。桔青霉在平板上成长模样以下图 1 所示。
常见的生态分布:腐烂的桔子、蔬菜、肉类以及衣服上面。多呈灰绿色。其可以或许导致常见的青霉病。 现实中桔青霉是生产抗生素中无可或缺的菌种，另外还有生产有机酸，如葡萄糖酸、柠檬酸的功能[16]。
1.2、 核酸酶 P1 的国内外生产研究现状。
早在 50 年月以前,从海外科研就能有了从蛇毒或小肠粘膜中提取核酸酶 P1 用于出产核苷酸的手艺，一些外国的科学家就可以够用微生物发酵的方式出产核酸酶 P1，而且跟着晶体学和蛋白质提纯手艺的成长在生物学中的普遍被利用, 越来越多的人们逐渐对该酶蛋白的分子结构和活性中心有了更多的钻研与希望，在此同时人们也进一步扩大了核酸酶P1 在医药、食物、和分子生物学等方面的利用远景[6]。核酸酶 P1 的结构和酶学特性的研究, 对于发展我国核苷酸工业有着重要的理论和现实意义。
我国的现状是具有很充足的先进的 RNA 生产工艺以及核糖核酸 RNA 的资源，常大量应用于核苷酸工业生产当中[14]。可是因为当今的生产环境有限，导致桔青霉发酵液中核酸酶P1 的活性较低,国内利用深层发酵法出产获得大量核酸酶 P1 的厂家少之又少，直接影响着核苷酸的出产。根据现在已有的情况,我们对桔青霉摇瓶发酵生产核酸酶 P1 的适宜条件进行了不同方向的因素实验,目的在于为以后进行的工业化生产核酸酶 P1 的产量提高打下良好的基础。
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1.3、核酸酶P1的组成结构以及生产原理.
1.4、核酸酶P1的用途.
1.5、研究提高核酸酶P1酶活的意义
2.实验材料
2.1、药品
2.2、实验仪器
3.试验方法
3.1、斜面以及平板的活化培养
3.2、种子培养基的配置
3.3、产酶基础培养基
3.4、培养基成分对酶活的影响
3.5、核酸酶P1酶活的测定方法
4.实验分析
4.1、种子液生长曲线的观测
4.2、核酸酶P1发酵培养基成分对酶活的影响
4.3、外部培养条件对发酵酶活的影响
4.4、发酵工艺研
5．分析总结
实验取实验室提供的桔青霉菌种作为实验菌种，在完成菌种活化之后，进行种子液培养，之后进行摇瓶的发酵。在原先的发酵内外条件基础以及发酵工艺上面做出不同因素的修改，以来探究实验室桔青霉的初步适合的生产工艺手段，通过单因子多样本的多次实验，误差大大减少。得出来如下发酵工艺：种子液使用 PDA 培养基进行活化培养，培养时间为 4~5 天。挖取 1cm3的菌苔进入种子培养液，种子培养液成分为葡萄糖 3% ， 蛋白胨 0.15% ，磷酸二氢钾 0.15%、磷酸氢二钾 0.15%，硫酸镁 0.24%，氯化钙 0.15%，p H6.5。
在 28℃，250r/min 的摇床里面培养 24h 时达到接种需要的最高菌株浓度，可以作为发酵培养的种子液。使用 1.5%蔗糖是碳源，倒入胰蛋白胨粉含量 0.6% ，摇瓶 0.05% 磷盐；0.01%硫酸锌，0.01%硫酸镁，0.08%氯化钙的金属离子，0.05%含量的吐温-80（皆为质量体积分数），p H 6.4 的条件来发酵产酶。接种量为接入发酵摇瓶的 15%的种子液，接完种之后将摇瓶放入 28℃，250r/min 的摇床中培养，在 72h 的时候达到酶的最高产峰。探索出来的新发酵条件相较之前的发酵条件，能够提升发酵的核酸酶 P1 酶活，为更高效的生产核酸酶 P1 提供了新的途径。
6.引用文献
[1] 南京医学院生物化学，北京人民卫生出版社， 1979， 128
[2] 徐正军，肖林平，吕洁等.实验设计法优化核酸酶P1的发酵培养基[I].过程工程学报,2003,3(5) : 433-437
[3]大连轻工业学院生物化学,北京轻工业出版社, 1980, 201-208
[4] 李科德,韩木兰,柏建玲,等.5' -磷酸二酯酶高产菌株的选育和发酵培养条件的优化[J].微生物学杂志2001 21(3):28 - -33
[5] 梁剑光,黄鹏，徐正军桔青霉发酵法生产核酸酶P1工艺条件及影响因素[J] .中国酿造,2007, 11:27-30
[6] 沈萍,范秀容，李广武微生物学实验[ M] .北京:高等教育出版社, 2000.214~ 215
[7] 娄永江,吴汉民，王海洪从桔青霉M71生产核酸酶P1及酶活提高途径的研究[J]. 宁波大学学报, 1997, 10(3): 21~28 .
[8] 山根恒夫生化反应工程[M] .西安西北大学出版社, 1991.222 ~ 223.
[9] 庆辉，马兴胜,袁艳玲,等磷酸二酯酶的提取[J] .酿酒, 2004, 31(1): 88- 90
[10] 邓义熹,赵劼,张亚雄，等麦芽根提取5'-磷酸二酯酶对RNA酶解工艺研究[J] 食品工业科技, 2010 (1) : 207- 209.
[11] 陈珊珊，曹剑红. Zn1+对5'-磷酸二酯酶活性的影响[]福建医药杂志, 1994, 16(3): 49
[12] 娄永江，吴汉民，王海洪从桔青霉M71生产核酸酶P1及酶活提高途径的研究[J]. 宁波大学学报, 1997, 20(3): 21-27
[13] 夏黎明.固定化桔青霉产生核酸酶P1的研究[J]. 微生物学报, 1998, 28(6): 449.453
[14]无锡轻工大学.微生物学，第二版[M]. 北京中国轻工业出版社, 1990. 194- 198.
[15] 杨家华,李爱芬，李绪青等桔青霉发酵生产核酸酶P1的适宜条件[]烟台大学学报(自然.科学与工程版)，1997, 10(2):106- 109.
[16] 无锡轻工大学微生物学,第二版[M]北京:中国轻工业出版社, 1990. 194- 198.
[17] 吴永宏酶法水解DNA制备5'-脱氧核甘酸的研究[D] .南京工业大学, 2005.
[18] 吕浩，应汉杰核酸酶P1的纯化和酶学性质研究[J].南京工业大学， 2004, 24(6): 66- 99
[19] 廖红东,莫晓燕，宋威核酸酶P1的分离纯化及部分酶学性质研究[J]. 中国医药工业杂志,2005, 36(9): 536-538。