常规石蜡包埋制作小血管光镜切片的方法和效果

　　小血管因其体积微小、组织薄弱，按照常规的石蜡包埋方法，在脱水透明浸蜡等过程中，由于器械夹持、加热等因素，很容易塌陷变形甚至损坏，最终得不到管腔较为规则和完整的血管光镜切片。为了解决这一困难，该研究采用琼脂预先包埋小血管再进行常规石蜡包埋制作光镜切片的方法和效果，并与单纯石蜡包埋法得到的结果进行了比较，现报道如下。

　　1、 材料与方法

　　1． 1 材料与试剂 以 4% 多聚甲醛固定好的昆明鼠胸主动脉为例，其血管管径约 1 mm，长度约 1. 3cm，见图 1。普通琼脂粉，规格为 1 ml 的一次性普通医用注射器，眼科剪，眼科镊，大头针，常规脱水包埋及 HE 染色所用试剂等。

　　1． 2 操作步骤

　　1． 2． 1 小血管预处理 将固定好的小血管分割成0. 5 ～ 1. 0 cm 若干段，或根据需要选择包埋长度。为了便于观察血管的位置，预先用伊红将血管染红。

　　1． 2． 2 琼脂预包埋 准备1 ml注射器，切去注射器乳头靠后部分。将普通琼脂粉预先配成 1. 5% 琼脂粉悬浊液，再放入微波炉中低火加热至50 ℃左右成液体状态，再将处理过的注射器活塞往外拉出 1. 5～ 2. 0 ml 距离作为模子，用移液枪将熔化的琼脂液加入注射器前端空缺处，并迅速将小血管段放入琼脂中，用缝衣针或大头针调整血管在琼脂中的位置，尽量使血管段居中，并用针尖小心探入血管管腔内，将其塌陷的部分挑起来使管腔成为规则的圆形腔。待琼脂冷却凝固后，将注射器活塞往前推出获得琼脂柱。

　　1． 2． 3 脱水再包埋 包含有血管段的琼脂柱作为一个整体再按照常规的脱水包埋程序做石蜡包埋。最后一步石蜡包埋时将琼脂柱竖立放于石蜡包埋模子中，并在其周围充满熔化的石蜡，便于后期切片。

　　1． 2． 4 切片和染色 包埋完毕后切片，石蜡切片厚度为 3 μm，染色采用常规 HE 染色。

　　2、 结果

　　琼脂石蜡双包埋法包埋的小血管组织块切片染色后，可观察到管腔完整和规则的血管横断面，血管内膜等组织结构保存较完好，几乎没有损坏和丢失。而单纯石蜡包埋法包埋的小血管组织块切片染色后，可观察到血管管壁打折和贴附在一起，变形甚至破裂的现象。

　　3、 讨论研究

　　表明琼脂石蜡双埋法在制作一些精细组织的光镜切片上有着很大优势，该研究应用在小血管的包埋和制片上也证实了这一点。采用琼脂石蜡双包埋法可保持小血管的管腔完整性和规则性，小血管内膜等组织结构保存较完好，几乎没有损坏和丢失，切片得到较为理想的结果。然而采用单纯石蜡包埋法包埋的小血管，在脱水包埋等操作过程中，血管的管壁容易贴在一起，且容易变形甚至破裂，最终得不到令人满意的光镜切片。

　　琼脂块脱水浸蜡加热之后体积会固缩一半以上，然而为了保证脱水完全，琼脂包埋块又不能过大，本实验证明课题组自制的 1 ml 注射器琼脂包埋模子较为适合管径为 1 ～3 mm 的小血管包埋所用，体积大小适中，且可以极为方便的将包埋琼脂块从模子中取出，避免了用器械从其他类型的琼脂包埋模子中取出琼脂块时，容易将已经包好组织的琼脂块夹烂碰损的情况发生。

　　包埋所用琼脂浓度不宜过高也不宜过低。高浓度琼脂(3% 以上)，使用相同剂量的脱水剂不能完全脱水，最终琼脂和石蜡不能很好的融合在一起，无法正常切片，推测原因可能是琼脂液密度过高导致琼脂块内部分子间隙过窄，脱水剂等不易浸入其内部。经过浓度梯度对照试验表明质量分数为 1. 5%琼脂用于包埋较为合适;琼脂浓度过低则不能很好的凝固，而且脱水之后严重固缩亦不能获得良好的效果。

　　用琼脂预包埋小血管最大的优势是在琼脂包埋血管时可以调整和恢复在取用或固定等操作时发生塌陷变形的血管原有的圆形管腔，且在整个脱水包埋过程中都起到一个很好的支撑和保护作用，使血管在其中不易被器械夹损，也不容易因加热等因素而变形和损坏，更为重要的一点是切片时遗留的琼脂具有黏附作用，染色洗片时不易掉片。

　　琼脂石蜡双包埋法还可适用于组织工程血管的包埋，因为血管脱细胞后失去弹性支撑会变得更加柔软，管腔更容易塌陷。本课题组用该方法包埋组织工程血管亦获得良好的效果。

　　琼脂石蜡双包埋法弥补了单纯石蜡包埋小血管时易损坏血管以致难以获得管腔完整和规则的血管光镜切片的不足，在小血管的光镜制片上具有明显的优势。该方法操作简便快捷，使用材料价格低廉，对条件一般的实验室开展动物实验有一定的实用价值。