新一代DNA测序的特点

　　在过去的几十年里，基因组测序已经深入到了几乎生命科学[1]的每个领域，包括人类基因组计划，生物医学科学领域中的细菌病原体和水稻基因组分析[2]等等。新一代测序的特点如下：

　　Helicos/HeliScope HeliScope单分子测序是第一个利用直接RNA和DNA测量的进行的基因分析。基因组DNA序列随机地被分成小块然后用Poly-A扩增3‘末端。在末端转移酶存在条件下，将Cy5荧光团添加至3’末端。小片段被捕获在表面，这些捕获的链充当合成定序过程的模板：添加聚合酶和一种荧光标记的核苷酸 （C、G、A 或T）。（1）聚合酶促进了所有模板中荧光的核苷酸与初期的互补链的序列特异性合并；（2）洗脱之后，移除了所有自由核苷酸，合并的核苷酸成像并记录位置；（3）荧光组在高效率的分裂过程中移除，剩下了合并的核苷酸；（4）同样的过程在其他三种碱基中也进行；（5）多样的四碱基循环导致了互补链在长度上长于数以亿计的模板中的25中碱基，每个循环都包括25个独立通道的两个流动插槽，同时96孔板能用于测序。这样，4800个样本能在同一循环中测序。

　　PacBio PacBio RS是一种单分子实时测序系统。为了得到高准确度的多样检测，SMRTbell 作为准备测序的方法。基因组测序来讲，DNA被随机分裂然后末端修复，继而3‘腺嘌呤被添加到碎片的基因组DNA,促进了接头和T环的连接。单个的DNA核苷酸，形成了一个分子内的哑铃结构，被用作接头。SMRTbell DNA模板在结构上是线性分子但是其套马环接头创造了拓扑的圆形分子。

　　SMRT形成了零模式波形数列[3].当序列反应开始时，引物与模板的单链环部位退火后，这个双链部位就可以结合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。将DNA聚合酶和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。每个荧光图案对应增长的DNA链中一个特殊的碱基。在碱基合成的起始阶段，荧光核苷酸被带至聚合酶的活性部位然后结合到ZMW底部。在ZMW底部，高分辨率相机记录了被合并的核苷酸荧光。

　　其他二代测序标记都在5’甲基上，在合成过程中荧光标记物留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力导致DNA链延长到一定程度后会出现错读。这是NGS的测序读长仅能达到100多bp到200bp的一个原因。

　　合成过程中，每次进入一个碱基，原始数据会实时地产生一个脉冲峰，每两个相邻的脉冲峰之间有一定的距离，这个距离的长短与模板上碱基是否存在修饰有关。如果有碱基修饰会导致两个相邻峰之间距离加大。根据这个距离的变化，可以实时判断模板相应位点是否出现碱基修饰。其局限性在于每个ZWM底部固定化的DNA聚合美的随机性，优点在于读取长度长，测序时间短。

　　全基因组 全基因组平台代表第一个作为公共服务的高通量测序平台，测序能力强。全基因组服务依赖于环状DNA文库的准备和滚环扩增过程产生在固体支持物上的DNA纳米球。

　　基因组DNA经超声处理打断，收集400-500bp的片段。片段尾端酶促修复，去磷酸化。普通的接头使用切口平移连接到DNA片段上。在夹板寡核苷酸存在条件下，进行产物消化，甲基化，线性化，接头连接，PCR扩增，限制性内切酶酶解，重复环化过程直至四个独特的已知接头合并进入环化序列文库分子。在最终的环化步骤之前，单链模板用磁珠捕获和核酸外切酶处理的方法链分离纯化。带着长线性产物的回文序列促进了分子内部螺旋和DNA纳米球的形成。在两端加接头，模板环化、酶切，最后产生大约 400 个碱基的测序片段。六甲基二硅氮烷覆盖的CGA平台流体室表面使用光刻法用氨基硅烷打点。然而，HDMS抑制DNA结合，带正电荷的氨基硅烷与带负电荷的DNBs结合。

　　全基因组的CGA平台使用了探针锚定序列连接方法即cPAL测序策略。在探针的第一个位置，4个退化的9-mer寡核苷酸通过与一个特殊的核苷酸（A、C、G或T）对应的特定荧光团标记。序列测定发生在正确配对探针与模板杂交，在T4 DNA连接酶作用下与锚链接的反应中。在连接产物成像后，连接的锚-探针分子变性。杂交、连接、成像和变性的过程使用包含有已知在n+1、n+2、n+3和 n+4位点处荧光标记的探针重复五次。

　　进行一个杂交和连接循环就要对带有DNA纳米球的芯片进行荧光成像，然后用甲酰胺溶液对DNA纳米球进行重建。这种循环被重复直到全部组合的探针和锚定序列被检测。这种方式减少了试剂消耗并去除了潜在的累积错误。

　　参考文献

　　[1]Pallen, M.J., Nelson, K. & Preston, G.M. 2007. BacterialPathogenomics （ASM Press）。

　　[2]Yu, J., Hu, S., Wang, J. et al. 2002, A draft sequence of therice genome （ Oryza sativa L.ssp.Indica）， Science, 295, 79-92.

　　[3]Thomas P.N., Denitsa M., Matthew B.K.et al.2011. Land-scape of Next -Generation Sequencing Technologies. Anal.Chem. 83, 4327-4341.