Wnt/Ryk信号通路对于神经形成的作用

　　前言

　　Wnt 蛋白是一类分泌型糖蛋白家族，其通过细胞表面受体介导的信号途径调控一系列的细胞行为，包括细胞分化、增殖、迁移以及基因表达等[1-3].已有研究表明 Wnt 信号转导通路参与了胚胎神经发育的过程[6,7],同时还与其它信号通路存在交叉协同，影响着通路下游基因。例如：NFAT 蛋白、Smad6 蛋白、Ca2+信号等参与调控 Wnt 信号通路[8-10].Wnt 通路的失调与人类的神经系统疾病有密切关系[11].经典 Wnt 信号通路即 Wnt/β-catenin 途径在进化过程中高度保守，构成此途径的主要信号分子及相关调控机制已得到基本阐明[12].Wnt 蛋白在动物神经系统的广泛分布及其对脑发育的影响己有诸多报道[13];在哺乳动物神经系统，Wnt/β-catenin 途径参与早期神经发育包括神经管及神经嵴发生形成也为一系列实验证实[14];其对于细胞增殖分化及命运决定的具体调控作用的得到更全面的探索[15];而近年更有证据显示 Wnt 家族在突触形成与皮层发育的模式发生中扮演了重要角色[16].

　　1 Wnt 经典信号通路对于神经形成的作用

　　已有研究表明，Wnt 信号蛋白存在多个受体，如β-catenin,FRL1,LRP5/6,Ror2 等[12,17],介导多种信号转导通路（如图 1 所示），进而影响神经干细胞的增殖和分化。其中，经典的 Wnt 信号转导通路是由 β-catenin 和核因子 Tcf（T cell factor）所介导[12].Wnt 信号通路通过调控 β-catenin 和 Tcf 的结合，刺激靶基因的转录。

　　Wnts 受体 Frizzled （Fz） 是在细胞膜上的 7 次跨膜受体蛋白，单个 Wnt 可以同多种 Fz 蛋白相结合，反之亦然。单次跨膜蛋白 LRP 同样作为经典 Wnt 信号通路启动的重要受体，与 Fz相互协调作用。当约束受体蛋白活性时，Wnt 信号通路的表达受到抑制。例如分泌蛋白 Dickkopf（Dkk）可使 LRP6 失活，干扰Wnt 通路正常表达。

　　在细胞质内，β-catenin、肿瘤抑制蛋白和两种激酶 CK1α、GSK3β 与细胞支架轴蛋白 Axin 复合形成蛋白复合物 Ax-in-APC-β-catenin- GSK3β-CK1α（APGC），该复合物调控着胞内 β-catenin 的含量。Axin 是复合物形成和拆分过程的重要因子，而 APC 被认为是细胞质内 β-catenin 的传导因子。

　　Salic, A. 等人发现，在缺乏 Wnt 信号蛋白的情况下，β-catenin 相继被 CK1α 和 GSK3β 所磷酸化，导致其泛素化，进而被蛋白酶体所降解[13].当细胞膜上受体未受配体时，蛋白复合体 APGC 的 β-catenin 的 N 端被 CK1α 和 GSK3β 磷酸化，而磷酸化后 β-catenin 被泛素连接酶 β-TrCP 识别。β-catenin 作为目标因子，最终被蛋白酶体降解。在此过程中，细胞核内的Groucho 与 Tcf 相互绑定共同抑制 Wnt 靶基因的转录。

　　一旦 Fz/LRP 复合受体结合 Wnts 蛋白，经典 Wnt 信号通路激活表达。Fz 将吸引 β-catenin 和激酶 GSK-3β 的上游功能因子 Dishevelled （Dsh）。LRP5/6 胞质尾区的 GSK3 和 caseinekinase I- γ （CK1 γ ）在 Wnt 信号的作用下使得 LRP5/6 末端的磷酸化，并与 Axin 结合。Dsh 和 Axin 通过各自的 DIX （Di-shevelled-Axin）结构域调控下游因子的活动。蛋白复合物因缺少 Axin 而解体，使得细胞质内 β-catenin 含量稳定积累。部分蛋白磷酸酶被证实在 Wnt 信号作用参与此调控过程[12].例如PP2A,通过与 Axin 和 APC 结合，和对复合蛋白体中 GSK3β产物去磷化，促进复合蛋白体的降解。复合蛋白体的降解最终导致 β-catenin 在细胞之内处于游离状态。

　　Wnt 信号蛋白可抑制 β-catenin 的磷酸化，使得其在细胞质内积累，并转运至核内，核内 β-catenin 与 Tcf 家族蛋白分子结合，进而刺激 Wnt 靶基因（干细胞维持基因）的表达[15].以维持神经干细胞的自我更新和增殖。靶基因受刺激前，Groucho与 Tcf 相互绑定形成的复合物结合到 DNA 双螺旋的小沟上，改变 DNA 螺旋旋转角度，抑制靶基因的转录表达。当细胞质内β-catenin 稳定积累，通过核孔转运入细胞核内。LEF-1/Tcf 的 N端结构域与 β-catenin 相互绑定，β-catenin 的 C 端转录激活剂与共激活剂结合。LEF-1/Tcf 的转录抑制作用立即变为转录激活，刺激 Wnt 靶基因转录表达。Wnt/β-catenin/LEF-1 信号通路被证实在非洲爪蟾蜍胚胎早期发育过程中诱导 sencondarybady axis （SBA）形成，参与胚胎发育的过程。

　　当 APC 突变后，将抑制胚胎干细胞向三胚层组织分化，干细胞持续增值。Wnt 信号可以促进神经祖细胞的有丝分裂，抑制细胞的分化，控制神经细胞的增殖分化平衡。而多种蛋白质已被证实可改变信号通路中的某个环节，控制 Wnt 信号通路，参与神经系统发育。在中枢神经系统中，β-catenin 信号能控制神经前体细胞的生长以及细胞增殖与分化。β-catenin 信号在脊髓背侧神经发育过程中，bone morphogenic protein （BMP）与Wnt/β-catenin 信号通路在 ventricular zone（VZ 区）激活神经祖细胞增殖，而在 mantle zone（MZ 区）信号通路活性受到抑制时，这些细胞分化为功能神经元。国内景乃禾课题组研究发现，Smad6 蛋白可抑制 Wnt/β-catenin 下游基因的表达，调控神经干细胞的自我更新与分化[8].鸡胚神经管发育过程中，在 inter-mediate zone（IZ 区）表达的 BMP 信号通路负调节因子 Smad6抑制了 BMP 与 Wnt/β-catenin 信号活性。转录抑制因子 CtBP被 Smad6 吸引与 β-catenin/Tcf4 结合，形成复合物，干扰Wnt/β-catenin 下游基因的表达，改变神经元的增殖分化状态。

　　此外，李林课题组与景乃禾课题组研究发现，NFAT 蛋白可对经典 Wnt/β-catenin 信号通路产生抑制作用，从而抑制神经祖细胞的增殖，促进其分化[9].在 Ca2+信号的作用下，细胞质中的 NFAT 蛋白家族去磷酸化，并成为基因转录的催化剂。在这个过程中，NFAT 蛋白的 Rel Homology Region （RHR） 区与Dsh 链接结合，打断经典通路中 Dsh 与 β-catenin-/Tcf 的生物链条。在 NFAT 蛋白与 Wnt 信号作用过程中，通过 RHR 抑制了经典 Wnt 信号通路的表达，使得神经祖细胞退出细胞周期进入了细胞分化阶段。NFAT 蛋白在神经祖细胞的增殖和分化的生物过程也起到重要作用。

　　2 Wnt/Ryk 非经典信号通路对于神经形成的作用

　　除 Wnt/β-catenin 经典信号通路外，近几年新发现的Wnt/Ryk 非经典信号通路对于神经形成也发挥着重要作用[18-20].Yoshikawa, S.等人于 2003 年已经发现 Ryk 蛋白为 Wnt 配体的非典型酪氨酸激酶新受体[17],Wnt 新受体 Ryk 的发现有助于深入理解神经发育中 Wnt 信号通路的作用机制。

　　通过基因敲除小鼠的研究，已经证明 Wnt 信号通路在胚胎发育过程中有重要的作用，尤其是神经系统的发育。Wnt 基因的突变会导致中脑、海马、脊髓、神经嵴等神经组织的缺失或异常。wnt-7a 直接参与突触前结构的形成。基因靶向实验说明了wnt 蛋白是神经系统的形成关键，同时也在神经干细胞的干细胞诱发起作用，而前体细胞增殖，神经发生，轴突导向，突触形成。神经发育的生长锥通过在细胞外环境的吸引和排斥诱因被引导到他们的目标。在生长锥上的特异受体能识别这些诱因并且转换信号，最终导致生长方向的改变。

　　Yoshikawa, S.等人研究结果表明，在胚胎脑皮层形成过程中，Ryk 蛋白在神经干细胞的分化中发挥重要作用[18],Ryk 和Wnt 家族成员之间的受体 - 配体交互作用对于哺乳动物的中枢神经系统发育过程十分重要。

　　在哺乳动物的枢神经系统中，wnt 蛋白在 Ryk 的引导下在穿越中线后参与了沿着脊髓的前后轴线的连合轴突，Wnt 在前后连和区具有最高的表达。在对胚胎干细胞的研究中发现可抑制胚胎干细胞向三胚层组织分化而维持其增殖状态，在脊髓的发育中，Wntl 和 Wnt3a 在神经管顶板区高表达，神经管内依次沿背部至腹部分布的三群中间神经元发生的分化受此信号的影响；缺少 Wntl 和 Wnt3a 信号将导致神经元数目的减少。

　　Wnt 蛋白、Fz3、LRP6 以及β-catenin 对于神经嵴的诱导发生及其分化也有作用，过量的 Wnt-l 和 Wnt-3a 表达将导致神经嵴细胞增多；而 Gsk-3β 的过量表达会导致神经嵴分子表达的明显下降。Wnt 信号还可能参与了神经嵴发育中细胞的谱系分化，可促进神经管细胞的增殖，作为主要表达于神经管背侧中线的两类 Wnt 蛋白，Wnt1 与 Wnt3a 浓度从背侧至腹侧逐步减低，因此导致越靠近神经管背侧的细胞，它们的增殖速率就越快，这一模型很好地解释了神经管发育过程中细胞增殖与分化的关系。

　　神经板、神经管头尾模式的建立中，Wnt 信号途径也起重要作用。CNS 神经网络的形成不仅有赖于神经前体细胞的定向分化，更依赖于神经元轴突的导向作用和之间的突触联系。

　　Wnt-7a 具有促进突触发生的作用。Wnt 基因作为高度保守的一个家族，它们在正常胚胎发育过程中参与了体轴与胚层形成、器官发生发育、干细胞分化和细胞命运起重要作用，从神经干细胞的增殖分化到轴突导向与突触形成，都有 Wnt 信号通路的参与。

　　Ryk 受体受到 Wnt 信号激活后，如何从膜转导到核内，进而激活相应靶基因（分化基因）的转录?针对这一问题，Lyu, J.等人发现，Ryk 蛋白在响应 Wnt 信号后，其跨膜结构域膜内部分（Intracelluar Domain, ICD）被早老素所剪切，并将 Ryk 膜内部分（Ryk-ICD）释放到细胞质内，由分子伴侣 Cdc37 蛋白阻止其泛素化和降解，然后 Ryk-ICD 转运至核内[21,22].RYK 的剪接对于前体细胞的神经分化十分重要，当前体细胞在神经分化时缺乏成纤维细胞生长因子，就会出现 Ryk-ICD,同样，当存在有成纤维细胞生长因子时，就不会出现 Ryk-ICD,这说明 RYK 在神经分化时起重要作用。这一 Ryk 剪切机制发生在新分化的神经元中[21].WNT5 mRNA 表达集中在中枢神经系统生长开始的阶段，这是在分化神经元开始延伸轴突的发展阶段，并在之后将会在胚胎发育中一直持续下去。

　　Ryk 作为新发现的 Wnt 非经典信号通路的受体。在神经系统的发育过程中，参与了轴突导向，突触发生神经干细胞分化等系列生命过程。同时，Ryk 蛋白还会影响经典 Wnt/β-catenin信号通路发生。因此，Ryk 蛋白对于神经系统的正常发育起到关键作用。所以，对于 Wnt/Ryk 信号机制的研究有着重要的意义。然而，Ryk-ICD 没有核定位信号，其进入核内的分子机制迄今还不是很清楚，Ryk 蛋白功能的完成是否需要其它蛋白因子的协助和调控?弄清楚这些问题将有助于理解大脑皮层发育过程神经干细胞分化中 Wnt-Ryk 信号通路的分子机制。

　　3 总结

　　Wnt 信号通路在神经系统发育过程中参与了神经干细胞的增殖、分化，神经元极性建立，轴突树突导向及突触的形成和细胞命运决定等生命过程。本文对经典 Wnt 信号通路 Wnt/β-catenin 途径阐述的同时也对 Wnt/Ryk 途径这一研究新领域做了简单讨论。Ryk 蛋白在神经系统的发育过程中，参与了轴突导向，突触发生神经干细胞分化等系列生命过程，影响神经系统正常发育。目前，在这方面仍有很多问题尚待研究进一步，是什么神经导向因子与 Ryk 作用的引导轴突的生长发育?Wnt蛋白和 Ryk 作用后是如何影响神经祖细胞分化过程?等。

　　Wnt/Ryk 信号通路的研究，将对理解神经系统发育过程，预防神经系统缺陷的发生等有重要意义。