硕士论文
中文摘要
目的： 探讨载脂蛋白 E（Apolipoprotein E,ApoE）基因敲除小鼠在内皮损伤情况下，左颈总动脉部分结扎术（Partial carotid ligation,PCL）对小鼠血管内膜增生、脂质数量、血管功能的影响，同时研究二甲双胍对 PCL 引起的小鼠血管损伤的保护作用。在细胞水平上研究二甲双胍对棕榈酸诱导内皮细胞损伤的作用及前动力蛋白 2（Prokineticin 2,PK2）、前动力蛋白受体 1（Prokineticin Receptor1,PKR1）、磷酸化内皮型一氧化氮合酶（Phosphate endothelial nitric oxide synthase,p-eNOS）、内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,eNOS）蛋白表达水平的变化。
方法：将 ApoE 基因敲除小鼠分为 4 组，分别是 PD（Paigen's high-fat diet）饮食组（对照组）、PD 饮食+左颈总动脉部分结扎手术组（PCL 手术组）、PD 饮 食+二甲双胍+手术组（PCL+二甲双胍组）、PD 饮食+二甲双胍组（二甲双胍组）。
通过HE染色法观察内膜增生情况；通过观察左颈总动脉血管外观判断左颈总动脉中脂质斑块的数量；通过油红 O 染色法判断脂质的分布位置以及脂质的数量。
通过记录预收缩血管环张力变化，判断二甲双胍对血管舒张功能的影响。通过高脂（棕榈酸）诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型，给予二甲双胍后，用 Westernblot 方法检测 PK2、PKR1、p-eNOS、eNOS 蛋白表达水平的变化。
结果： 在动物实验中，1. 二甲双胍抑制左颈总动脉内膜的增生面积。相比于对照组，PCL手术组小鼠左颈总动脉中内膜增生面积显著增加。相比于PCL手术组，PCL+二甲双胍组小鼠左颈总动脉内膜增生面积显著减少。相比于对照组，二甲双胍组小鼠左颈总动脉内膜增生面积显著减少。2. 二甲双胍减少左颈总动脉中脂质含量。相比于对照组，PCL手术组小鼠左颈总动脉中脂质面积显著增加。相比于PCL手术组，PCL+二甲双胍组小鼠左颈总动脉脂质面积显著减少。相比于对照组，二甲双胍组小鼠左颈总动脉脂质面积显著减少。3. 二甲双胍减少左颈总动脉中脂质斑块形成相比于对照组，PCL手术组小鼠左颈总动脉脂质斑块长度与左颈总动脉血管总长度的比值显著升高。相比于PCL手术组，PCL+二甲双胍组小鼠左颈动脉脂质斑块长度与左颈总动脉血管总长度的比值显著降低。相比于对照组，二甲双胍组小鼠左颈动脉脂质斑块长度与左颈总动脉血管总长度的比值显著降低。4. 二甲双胍改善胸主动脉血管功能。相比于对照组，PCL手术组小鼠胸主动脉舒张显著降低。相比于PCL手术组，PCL+二甲双胍组小鼠胸主动脉舒张性显著升高。相比于对照组，二甲双胍组小鼠胸主动脉舒张性显著升高。在细胞实验中，1. 二甲双胍改善棕榈酸诱导的人脐静脉内皮细胞损伤作用。通过检测细胞的存活率发现，棕榈酸处理组细胞存活率显著降低，在给予二甲双胍治疗后，细胞的存活率显著上升。2. 棕榈酸下调其诱导的人脐静脉内皮细胞损伤中PK2、PKR1蛋白的表达水平。棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞发生高脂损伤后，PK2、PKR1蛋白的表达水平显著降低。3. 二甲双胍上调棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞损伤中PK2、PKR1蛋白表达水平。在人脐静脉内皮细胞中，棕榈酸下调PK2、PKR1蛋白表达水平，在给予二甲双胍后，PK2、PKR1蛋白表达水平升高。4. 二甲双胍上调棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞损伤中p-eNOS蛋白表达水平。 在人脐静脉内皮细胞中，棕榈酸下调p-eNOS蛋白的表达水平，在给予二甲双胍后，p-eNOS蛋白表达水平升高。
结论：在 ApoE 基因敲除小鼠中，在颈总动脉进行 PCL 手术产生内皮损伤后，血管出现明显的内膜增生、脂质数量增多、血管舒张功能下降；在给予二甲双胍后，颈总动脉血管内膜增生受到抑制，同时血管中脂质数量减少、血管舒张功能上升。表明二甲双胍减轻血管内膜增生、减少血管中脂质数量、增加血管功能。
在人脐静脉内皮细胞中，棕榈酸减少细胞存活率，降低 PK2、PKR1 蛋白的表达水平，降低 p-eNOS、eNOS 蛋白的表达水平；在给予二甲双胍后，细胞存活率显著升高，PK2、PKR1 蛋白的表达水平也显著升高。因此，二甲双胍减轻血管内膜增生的作用可能与上调 PK2、PKR1 的水平有关。
关键词：二甲双胍，PCL,PK2,PKR1,内膜增生
abstract
Objective: To investigate the effects of partial ligation of left common carotid artery （PCL） on intimal hyperplasia, lipid quantity and vascular function in apolipoprotein E （ApoE） knockout mice with endothelial injury, and to study the protective effect of dimethylbiguanidine on vascular injury in mice. The effects of metformin on palmitic acid-induced endothelial cell injury were studied at the cellular level, including prokinetin 2 （PK2）， prokinetin receptor 1 （pkr1）， phosphorylated endothelial nitric oxide synthase （p-enos）， and endothelial nitric oxide synthase （eNOS）， The expression level of eNOS protein was changed.
Methods: apoE knockout mice were divided into four groups: PD （paigen's high fat diet） diet group （control group）， PD diet + left common carotid artery partial ligation group （PCL operation group）， PD diet + metformin + operation group （PCL + metformin group）， PD diet + dimethylbiguanide group （metformin group）。
He staining was used to observe the intimal hyperplasia; the appearance of left common carotid artery was used to determine the number of lipid plaques in the left common carotid artery; oil red O staining was used to determine the distribution and quantity of lipids.
The effect of metformin on vasodilation was evaluated by recording the changes of tension in pre contractile rings. The expression of PK2, pkr1, p-enos and eNOS were detected by Western blot after metformin was given to human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） injury model induced by high-fat （palmitic acid）。
Results: 1. Metformin inhibited the intimal hyperplasia area of left common carotid artery. Compared with the control group, the intimal hyperplasia area of left common carotid artery in PCL group was significantly increased. Compared with PCL group, the area of left common carotid artery intima hyperplasia in PCL + metformin group was significantly reduced. Compared with the control group, the intimal hyperplasia area of left common carotid artery in metformin group was significantly reduced. 2. Metformin reduces the lipid content in the left common carotid artery. Compared with the control group, the lipid area of left common carotid artery in PCL group was significantly increased. Compared with PCL group, the lipid area of left common carotid artery in PCL + metformin group was significantly reduced. Compared with the control group, the lipid area of left common carotid artery in metformin group was significantly reduced. 3. Metformin reduced the formation of lipid plaque in left common carotid artery. Compared with the control group, the ratio of lipid plaque length of left common carotid artery to total length of left common carotid artery in PCL group was significantly increased. Compared with PCL group, the ratio of lipid plaque length of left carotid artery to total length of left common carotid artery was significantly decreased in PCL + metformin group. Compared with the control group, the ratio of lipid plaque length of left carotid artery to total length of left common carotid artery was significantly decreased in metformin group. 4. Metformin improves the function of thoracic aorta. Compared with the control group, the relaxation of thoracic aorta in PCL group was significantly decreased. Compared with PCL group, the relaxation of thoracic aorta in PCL + metformin group was significantly increased. Compared with the control group, the relaxation of thoracic aorta in metformin group was significantly increased. In cell experiment, 1. Metformin ameliorates palmitic acid-induced injury of human umbilical vein endothelial cells. Through the detection of cell survival rate, it was found that the cell survival rate of palmitic acid treatment group was significantly reduced, and the cell survival rate was significantly increased after metformin treatment. 2. Palmitic acid down regulates the expression of PK2 and pkr1 in HUVEC injury induced by palmitic acid. After palmitic acid induced high-fat injury of human umbilical vein endothelial cells, the expression levels of PK2 and pkr1 protein were significantly decreased. 3. Metformin upregulates the expression of PK2 and pkr1 in human umbilical vein endothelial cells injured by palmitic acid. In human umbilical vein endothelial cells, palmitic acid down regulated the protein expression of PK2 and pkr1, but increased after metformin treatment. 4. Metformin upregulates the expression of p-enos protein in human umbilical vein endothelial cells injured by palmitic acid. Palmitic acid decreased the expression of p-enos protein in human umbilical vein endothelial cells, and increased after metformin administration.
Conclusion: in ApoE knockout mice, after PCL of common carotid artery produces endothelial injury, obvious intimal hyperplasia, increased lipid content and decreased vasodilation function; after metformin administration, the intimal hyperplasia of common carotid artery was inhibited, while the quantity of lipid in blood vessel decreased and the vasodilation function increased. It is suggested that metformin can reduce intimal hyperplasia, decrease lipid content and increase vascular function.
In human umbilical vein endothelial cells, palmitic acid decreased the cell survival rate, the expression of PK2 and pkr1 protein, and the expression level of p-enos and eNOS protein; after metformin treatment, the cell survival rate was significantly increased, and the expression level of PK2 and pkr1 protein was also significantly increased. Therefore, the effect of metformin on vascular intimal hyperplasia may be related to the up regulation of PK2 and pkr1.
Key words: metformin, PCL, PK2, pkr1, intimal hyperplasia
目录
缩略词表………………………………………………1
中文摘要………………………………………………2
ABSTRACT ………………………………………………4
前言……………………………………………… 7
材料与方法 9
1. 主要材料 ……………………………………………… 9
1.1 实验动物、细胞株 9
1.2 主要仪器和设备 ………………………………………………9
1.3 主要实验药品及实验试剂 10
1.4 主要试剂的配制 11
2. 实验方法 ……………………………………………… 12
2.1 构建 ApoE 基因敲除小鼠颈总动脉部分结扎模型[34]………………………………………………12
2.2 小鼠血管取材………………………………………………13
2.3 组织石蜡包埋、制备切片 13
2.4 HE 染色………………………………………………13
2.5 蛋白质印迹法………………………………………………13
2.6 血管环实验 ………………………………………………14
3. 数据处理与统计方法 ……………………………………………… 16
结果 17
1.二甲双胍抑制左颈总动脉内膜的增生 ……………………………………………… 17
2.二甲双胍减少左颈总动脉中脂质含量 ……………………………………………… 17
3.二甲双胍减少左颈总动脉脂质斑块的形成 ……………………………………………… 18
4.二甲双胍改善胸主动脉血管功能 ……………………………………………… 19
5.二甲双胍保护棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞损伤作用 ……………………………………………… 20
6.棕榈酸下调人脐静脉内皮细胞中 PK2、PKR1 蛋白表达水平 ……………………………………………… 21
7.二甲双胍上调棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞损伤中 PK2、PKR1 蛋白表达水平 . 22
8.二甲双胍上调棕榈酸诱导人脐静脉内皮细胞损伤中 p-eNOS 蛋白表达水平 ……………………………………………… 22
讨论………………………………………………24
结论………………………………………………26
参考文献………………………………………………27
综述………………………………………………31
致谢………………………………………………37
前言
动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种动脉血管壁结构发生改变的心血管疾病，是心血管系统疾病中最为常见且对健康影响最严重的疾病之一[1].它包括动脉血管壁的持续炎症过程和氧化应激[2-3].表现为大动脉血管的脂质沉积，形成粥样硬化斑块。随着对 AS 的深入研究，目前逐渐形成了脂质浸润学说、内皮损伤学说、炎症反应学说等多种假说[4-6].近些年，在研究 AS 发生发展过程中，逐渐认识到内皮损伤学说的重要作用。
部分结扎术（Partial carotid ligation,PCL）是近些年来形成的一种新的造成动物血管内皮损伤模型的新方法[7].通过 PCL 方法，使血管结构发生改变，导致血流表现为湍流，血流长期不断刺激血管壁，导致血管内膜的完整性受损，通透性改变，最终降低血管内膜的屏障作用，血液中的脂质更加容易穿透血管内膜渗入到血管壁中，在受损的血管内膜下大量沉积[8-9].已有研究发现，低密度脂蛋白氧化后，在血管紧张素Ⅱ和内皮素-1 的作用下，使瘦素样氧化型低密度脂蛋白受体-1 的表达升高，进而使多种细胞黏附分子的表达升高，导致单核细胞与内皮细胞之间的黏附性增加，最终促使单核细胞迁移到内膜下转变成巨噬细胞，巨噬细胞吞噬大量氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞[10].另外损伤的内皮细胞、巨噬细胞和血小板分泌并释放大量的肿瘤坏死因子-α、白介素-1 和白细胞介素-6 等炎症因子[11-12].这些炎症因子和其他血管活性物质可以刺激血管平滑肌细胞向内膜下增殖迁移，导致脂肪斑块不断变大，形成动脉粥样硬化病变[11].因此，血管内皮受损导致的功能紊乱是形成动脉粥样硬化的因素之一。
二甲双胍是临床常用的降糖药物，近年来，在临床上，它的其他作用也备受关注[13-14].有研究发现，2 型糖尿病是 AS 的危险因素之一，二甲双胍可有效控制 2 型糖尿病合并 AS 患者的血糖，患者血糖波动小，血管炎性指标也可获得明显改善，可降低患者潜在的心血管风险[15-17].研究表明，在 ApoE 基因敲除小鼠中，二甲双胍通过上调肝脏胆固醇逆向转运相关蛋白的表达，增强肝脏胆固醇逆转运能力，调节血脂代谢、减轻肝脏脂质沉积[18-19].在巨噬细胞发现通过给予二甲双胍治疗可以促进胆固醇的外流，并且可以上调腺苷三磷酸结合转运体的表达，从而达到抗 AS 的目的[20-21].研究发现，在链脲佐菌素诱导的糖尿病 ApoE 小鼠中，二甲双胍可以减少线粒体破裂，抑制血管炎症，改善内皮依赖的血管舒张，并且发挥抑制 AS 作用[22].
PK2（Prokineticin 2,PK2）是一种体内分泌的小分子多肽，在心肌细胞、心血管组织、淋巴器官、外周血细胞、树突细胞和脑中高度表达[23-24].它与两个 G蛋白偶联受体，分别是 PKR1（Prokineticin receptor 1,PKR1）和 PKR2（ProkineticinReceptor 2,PKR2）结合，发挥调节生物学功能的作用，包括肠道运动、昼夜节律、神经生成血管生成、癌症的发生发展、造血和痛觉等多种功能[25-29].研究发现，在小鼠后肢缺血的模型中，给予 PK2 后通过调节血管生成促使了血管的新生和血流的恢复[30-31].Guilini C[33]研究也发现，在小鼠冠脉 H5V 内皮细胞中，PK2 通过激活 PKR1/MAPK/Akt 信号通路，诱导细胞管状样结构形成，维持内皮细胞功能完整。这些研究表明，PK2 可能通过诱导血管生成/新血管生成来改善组织循环，从而对组织修复产生有益影响。因此，PK2 及其受体可能成为治疗内皮损伤引起的 AS 的一个新靶点。
本研究拟在 ApoE 基因敲除小鼠中，通过颈总动脉部分结扎术，同时给予 PD饮食，建立颈总动脉内皮损伤诱导的 AS 模型，研究激活二甲双胍对小鼠颈总动脉内膜增生、脂质斑块形成、脂质沉积、血管功能的影响。在人脐静脉内皮细胞中，通过棕榈酸损伤内皮细胞的模型，研究二甲双胍对内皮细胞中 PK2、PKR1、p-eNOS、eNOS 蛋白表达水平变化。有望阐明二甲双胍抑制内膜增生、减少脂质聚集，减缓 AS 发生发展的作用与机制，深化对 AS 发病机制的认识，也为防治AS 提供新的药物作用靶点。
材料与方法
1. 主要材料
1.1 实验动物、细胞株
实验动物：30 只 8 周龄 ApoE 基因敲除小鼠，雄性，22-25g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养环境为白天和晚上各 12 小时，并保持充足的水和食物。所有的实验方案均经过湖北科技学院动物伦理委员会批准。
细胞株：人脐静脉内皮细胞，购于武汉华联科生物技术有限公司。
1.2 主要仪器和设备
1.3 主要实验药品及实验试剂试剂。
1.4 主要试剂的配制
MTT 工作液：称取 50mg MTT 粉末，溶于 10ml PBS 中，混悬，用 0.22μm滤器过滤，避光保存。
棕榈酸工作液：由于棕榈酸是脂溶性物质，不溶于水，配制时需要牛血清白蛋白进行助溶。称取 2.564g 的棕榈酸放入 1ml 无水乙醇中，摇至溶解，制备成100mM 棕榈酸母液；称取 1g 牛血清白蛋白（BSA）在 55℃水浴条件下制备 10%牛血清白蛋白（BSA）溶液，将棕榈酸母液与 10%牛血清白蛋白（BSA）溶液按适当比例充分混合，制备 1mM 棕榈酸储存液，0.22μm 滤膜过滤后分装，-20℃保存待用。用前在 55℃水浴 10min,自然冷却至 37℃时使用。
蛋白提取液：将 10μl 的 PMSF 加入到 1ml RIPA 组织裂解液中。
10%过硫酸铵：称取 0.1g 过硫酸铵粉末，溶于 1ml 超纯水中，避光保存。
5%脱脂奶粉封闭液：称取 5g 的脱脂奶粉，溶于 100ml TBST 中，4℃保存。
10%吐温 20:取 20ml 吐温 20,用超纯水定容至 200ml.
1×TBST:取 10×的 TBS 100ml,加入 900ml 超纯水，再加入 10%的吐温 20溶液 5ml.
1×电泳液：取 10×电泳液 100ml 加入 900ml 的超纯水。
1×转膜液：取 10×电泳液 100ml 加入 200ml 甲醇，用超纯水定容至 1L.
一抗配置：按照说明书比例，将一抗溶于抗体稀释液中。
二抗配置：按照说明书比例，将二抗溶于抗体稀释液中。
2. 实验方法
2.1 构建 ApoE 基因
敲除小鼠颈总动脉部分结扎模型[34]
（1）。8 周龄 ApoE 基因敲除雄鼠麻醉后，固定到手术台上，用脱毛膏脱去颈部的毛发，然后用 75%乙醇消毒。
（2）。在颈部中线向左 2mm 处皮肤作 4-6mm 的纵形切口，用手术镊钝性分离颈部的腺体及脂肪，在气管左侧找到左颈总动脉，血管位置较深，需要小心分离，出血后会导致视野不清晰。
（3）。沿左颈总动脉向小鼠远心端方向寻找其第一个分叉并钝性分离周围的粘膜组织和神经，暴露出分叉处的四根血管，分别是左颈内动脉（internal carotid artery,ICA）、左颈外动脉（external carotid artery,ECA）、左甲状腺上动脉（superiorthyroid artery,STA）、枕动脉（occipital artery,OA），如图 1.在左甲状腺上动脉上方 2mm 处用 6-0 手术线结扎左颈外动脉，另取一根 6-0 手术线穿过颈内动脉和枕动脉，将两根血管一起结扎。对齐颈部手术切口，用 4-0 手术线缝合，再次用 75%乙醇消毒切口附近皮肤，将小鼠放到热盘上，苏醒后放入笼中并做好标记。
将小鼠分为 4 组，PD 饮食组（对照组）6 只、PD 饮食+颈总动脉部分结扎手术（PCL）组（PCL 手术组）9 只、PD 饮食+二甲双胍+手术组（PCL+二甲双胍组）9 只、PD 饮食+二甲双胍组（二甲双胍组）6 只。所有组别的饲料均为 PD 高脂饲料，PCL+二甲双胍组和二甲双胍组按照每日 300mg/kg 的剂量给予二甲双胍，喂养 8 周后取材。
2.2 小鼠血管取材
将小鼠深度腹腔麻醉，仰卧位固定，从腹腔打开至胸腔，剪断上下腔静脉，从左心室灌注肝素钠生理盐水（肝素钠 10u/ml），直至肺部和肝脏变白，然后灌注组织固定液进行在体固定，对主动脉弓、左颈总动脉、右颈总动脉、胸主动脉予以取材。
2.3 组织石蜡包埋、制备切片
（1）。充分固定后的血管组织脱水：50%乙醇开始，经过 70%、85%、90%、95%、100%乙醇完全脱水，每个乙醇浓度脱水 1.5h,脱水过程中，乙醇的浓度跨度不宜过大，否则容易引起组织变形。
（2）。二甲苯透明、浸蜡：将完全脱水的组织放入二甲苯中透明 1h,再放入 60℃二甲苯-石蜡混合物中 1h,最后将组织浸入在石蜡中 1h.
包埋：将浸蜡的组织用相同蜡进行包埋。
（3）。用切片机切成 5μm 厚度的石蜡切片，43℃摊片。67℃烤片。
2.4 HE 染色
（1）。水化：将石蜡切片依次将放入二甲苯Ⅰ 10min、二甲苯Ⅱ 5min、无水乙醇 5min、95%乙醇 3min、90%乙醇 3min、85%乙醇 3 min、70%乙醇 3min、蒸馏水洗 2 min.
（2）。苏木素染细胞核：将玻片浸泡在苏木素中，染色 5min,自来水洗 1min,1%盐酸乙醇分化 5s,自来水冲洗 1min,氨水返蓝 1min.自来水冲洗。
（3）。伊红染细胞质：将玻片放入盛有伊红溶液的染缸中染色 2min,放入 85%的乙醇中分化 2min.
（4）。脱水封片：将切片依次放入 90%乙醇 5min、95%乙醇 5min、100%乙醇 5min、二甲苯Ⅰ 5min、二甲苯Ⅱ 5min.将切片拿出后滴加中性树脂封片。
2.5 蛋白质印迹法
（1）。组织样本预处理：称取适量组织样本，按照 1:10 加入蛋白提取液，放入匀浆机中低温匀浆 2min.
（2）。细胞样本预处理：向含有细胞的六孔板中加入 100μl 的蛋白提取液，冰上作用 30min,轻轻刮取，收集到 1.5ml EP 管中。
（3）。收集蛋白质上清液：4℃，12000 rpm/min,离心 10min,将上清移至新的 EP管中，BCA 法测定蛋白浓度（具体方法见说明书）。
（4）。蛋白质预处理：将各个样本浓度调至相同，加入 3×蛋白质上样缓冲液（体积为蛋白质上清液的 1/3），吹打混匀，放到恒温震荡金属浴中 300rpm/min,95℃变性 10min.-20℃保存。
（5）。聚丙烯酰胺凝胶的制备
（6）。电泳：将制备好的聚丙烯酰胺凝胶固定在电泳槽中，加入配制好的电泳液，注意液外侧液面需要高于凝胶的下端，每孔上样 30μg 蛋白，调整电压至 70V,恒压电泳，待蛋白 marker 分离开后，将电压调至 120V 继续电泳，直到蓝色的条带距离玻璃板底端 1cm 处停止电泳。
（7）。转膜：根据蛋白的位置切胶，剪取适当大小 PVDF 膜，做好标记，浸泡到甲醇中。将转膜夹、海绵及滤纸完全浸泡转膜液，除去气泡。在转膜夹白色面依次放上 1 层海绵垫、2 层滤纸、含有蛋白质的凝胶、PVDF 膜、两层滤纸。将转膜夹闭合，放入转膜槽中，加入冰砖，置于冰盒中，然后 300mA 电流恒流转膜 80min.
（8）。封闭：转膜完成后，做好标记，将膜放入 5%牛奶封闭液中，封闭 90min.
（9）。孵育一抗：将膜放于脱色摇床中，用 TBST 洗涤 3 次，每次 5min.将膜按照目的蛋白位置进行切割。分别孵育对应的一抗，于 4℃过夜。
（10）。孵育二抗：孵育完一抗后，将膜放于脱色摇床中，用 TBST 洗涤 3 次，每次5min.孵育对应的二抗，于室温 1h.
（11）。显影：孵育完二抗后，将膜放于脱色摇床中，用 TBST 洗涤 3 次，每次 5min.
配制新鲜的显影液浸泡 PVDF 膜 2min,放于化学发光仪中进行曝光拍照。
（12）。结果分析：采用 Image J 软件进行蛋白质条带的灰度分析。采用 GraphPadprism6 软件统计各个蛋白质表达的差异性。
2.6 血管环实验
（1）。打开仪器设备及工作站，清洗仪器，并校准设备。
（2）。在 DMT620 多通道离体微血管张力测定系统张力浴槽内填充预冷的 Krebs-Henseleit 溶液并通入氧气。
（3）。处死动物，迅速解剖并分离血管周围组织并取出约 1cm 主动脉血管组织，放置于装有 4℃预冷的 Krebs-Henseleit 的培养皿中，轻轻晃动血管，清洗血管表面及血管内残留血液。
（4）。将培养皿放置于体式显微镜下，使用微型镊、微型剪等工具将血管周围的脂肪和粘膜分离干净，注意不能拉扯，以免损伤血管壁。
（5）。用显微剪取一段长约 3mm 的血管环，尽量选取血管中间位置或者损伤较轻的位置。
（6）。将取下的血管环转移到张力浴槽中。用两根 25μm 的钨丝穿过血管环，注意此过程不要触碰到血管内壁，避免血管结构遭到破坏，然后将钨丝分别固定于张力浴槽的两端。调整张力槽中的螺丝使钨丝处于平行状态，同时调整钨丝的间距，使血管处于放松状态。
（7）。轻轻将张力槽放到设备上，并通入氧气，连接传感器，观察工作站中张力的变化。
（8）。打开加热开关，使张力槽中的液体升至 37℃，同时更换一次张力槽的液体。
（9）。等到张力槽中液体温度上升至 37℃后，旋转张力槽上手柄，使血管的初始张力为 5mN.此过程中，调整手柄时一定要慢，防止张力变化速度过大导致血管损伤。
（10）。在调整过程中，每间隔 15min 更换一次槽内的液体，注意液体需要预热至37℃，并通入氧气，平衡总时间为 60min.在平衡过程中，每隔 5min 左右旋转螺旋尺调节张力值，使张力维持在 5mN 左右。
（11）。点击工作站启动按钮，开始记录张力的变化。
（12）。将张力槽中的液体迅速排空，然后立即加入预热至 37℃的 60mM 的高钾Krebs-Henseleit 溶液，注意液面要高于血管，在工作站中添加标记。
（13）。等待其上升至平台期，使用 37℃预热通气的气的 Krebs-Henseleit 洗脱 3 次，直到张力处于基线位置。再次平衡 15min.
（14）。再次排空张力槽中的液体。立即加入预热至 37℃的 60mM 的高钾 KrebsHenseleit 溶液，注意液面要高于血管，在工作站中添加第二次标记。等待其上升至平台期，按上一步骤的方法洗脱血管直至张力降到基线位置。
（15）。静止 20min,带血管状态稳定，添加 U46619 收缩剂，刺激至平台期，并维持在平台。
（16）。依次添加乙酰胆碱（浓度为 10-9,10-8,10-7,10-6,10-5M）。分别舒张 2min.观察血管舒张程度并做好标记。
（17）。连续换 3 次 Krebs-Henseleit 液，待血管张力重新平衡到 5mN,等待 15min,添加 U46619 收缩剂，刺激至平台期，并维持在平台。
依次添加硝普纳（浓度为 10-9,10-8,10-7,10-6,10-5M）。分别舒张 2min.观察血管舒张程度并做好标记。
（18）。结束实验，保存文件并清洗仪器。
3. 数据处理与统计方法
本研究数据采用均数±标准误（MEAN±SEM）表示，利用 GraphPad Prism 6.0和 PowerPoint 2016 软件进行数据输出和作图。两组间均数比较采用 t 检验进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05时有显著差异，P>0.05为无显著差异。
【由于本篇文章为硕士论文，如需全文请点击底部下载全文链接】
结论
本研究主要利用 ApoE 基因敲除小鼠通过颈总动脉部分结扎术建立 AS 模型和人脐静脉内皮高脂损伤模型，研究 PK2、PKR1 信号在动脉粥样硬化发生发展的作用。主要结果如下：
、二甲双胍可抑制 ApoE 基因敲除小鼠内膜增生，减缓颈总动脉粥样硬化的斑块形成。
、二甲双胍可增加 ApoE 基因敲除小鼠中受损的血管舒张功能。
、二甲双胍可上调棕榈酸减少的 PK2、PKR1 蛋白表达水平。
综上所述，研究表明，二甲双胍可能通过上调 PK2、PKR1 的表达，减少血管内膜增生，减少颈动脉斑块的形成，延缓 AS 的进程。
参考文献
[1] 刘俊田 . 动脉粥样硬化发病的炎症机制的研究进展 [J]. 西安交通大学学报 （ 医 学版），2015,36（02）：141-152.
[2] Liang X, Xiu C, Liu M, Lin C, Chen H, Bao R, Yang S, Yu J. Platelet-neutrophil interaction aggravatesvascular inflammation and promotes the progression of atherosclerosis by activating the TLR4/NF-κBpathway[J]. Journal of cellular biochemistry. 2019, 120（4）： 5612-5619.
[3] da Silva Rose Mary Ferreira Lisboa. Influence of Inflammation and Atherosclerosis in AtrialFibrillation.[J] .Curr Atheroscler Rep, 2017, 19: 2.
[4] 杨先梅。 动脉粥样硬化的发病机制研究[J]. 现代医药卫生。 2013, 29（18）： 2871-2872.
[5] 张昭华，庞敏。动脉粥样硬化的发病机制综述[J].基层医学论坛，2018,22（34）：4918-4919.
[6] 张健美，景永帅，张丹参。动脉粥样硬化的发病机制及治疗[J].中国药理学与毒理学杂志，2019,33（06）：472.
[7] Kumar Sandeep,Kang Dong-Won,Rezvan Amir et al. Accelerated atherosclerosis development inC57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.[J] .Lab. Invest., 2017,97: 935-945.
[8] Olivecrona G. Role of lipoprotein lipase in lipid metabolism[J]. Current opinion in lipidology. 2016,27（3）： 233-241.
[9] 景晓霞，高宇平，张芸芸，刘艳杰。肥胖与动脉粥样硬化的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2019,17（10）：1490-1492.
[10] Merino Hilda,Parthasarathy Sampath,Singla Dinender K,Partial ligation-induced carotid arteryocclusion induces leukocyte recruitment and lipid accumulation--a shear stress model ofatherosclerosis.[J] .Mol. Cell. Biochem., 2013, 372: 267-273.
[11] 李梅， 赵雪芹， 王同兆， 王磊。 动脉粥样硬化的发病机制及治疗的综述[J]. 科技视界。 2017,（26）： 35-36+52.
[12] 王新，李春阳，苏立平，周阳。动脉粥样硬化发病机制及治疗的研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志，2017,25（02）：1-4.
[13] 母义明，纪立农，宁光等。二甲双胍临床应用专家共识（2016 年版）[J].中国糖尿病杂志，2016,24（10）：871-884.
[14] 潘小康。二甲双胍降糖机制研究进展[J].中国糖尿病杂志，2016,24（07）：665-668.
[15] 曾隽，欧婕，何云美，蔡春钰。二甲双胍对 2 型糖尿病合并动脉粥样硬化患者血糖波动及动脉粥样硬化病变的影响[J].世界临床药物，2016,37（08）：551-555.
[16] Mamputu JC, Wiernsperger NF, Renier G. Antiatherogenic properties of metformin: theexperimental evidence[J]. Diabetes & metabolism. 2003, 29: 6S71-6.
[17] 石维。 2 型糖尿病合并动脉粥样硬化的发病机制、临床诊断与治疗[J].中国老年学杂志，2016,36（07）：1777-1781.
[18] 王夏蕾，杨景达，魏伟，沈菊连，陆璐，吕昕儒，肖建平，薛偕华。二甲双胍介导胆固醇逆转运抑制动脉粥样硬化[J].中国药理学通报，2020,36（04）：496-501.
[19] Jenkins Alicia J,Welsh Paul,Petrie John R,Metformin, lipids and atherosclerosis prevention.[J] .Curr.Opin. Lipidol., 2018, 29: 346-353.
[20] Luo Fei,Guo Yuan,Ruan Gui-Yun et al. Combined use of metformin and atorvastatin attenuatesatherosclerosis in rabbits fed a high-cholesterol diet.[J] .Sci Rep, 2017, 7: 2169.
[21] Asai Akira,Shuto Yuki,Nagao Mototsugu et al. Metformin Attenuates Early-Stage Atherosclerosisin Mildly Hyperglycemic Oikawa-Nagao Mice.[J] .J. Atheroscler. Thromb., 2019, 26: 1075-1083.
[22] Wang Qilong,Zhang Miao,Torres Gloria et al. Metformin Suppresses Diabetes-AcceleratedAtherosclerosis via the Inhibition of Drp1-Mediated Mitochondrial Fission.[J] .Diabetes, 2017, 66: 193-205.
[23] Burton Katherine J,Li Xiaohan,Li Baoan et al. Expression of prokineticin 2 and its receptor in themacaque monkey brain.[J] .Chronobiol. Int., 2016, 33: 191-199.
[24] 黄聪，郭敏，陈娟，蔡飞，张又枝。前动力蛋白 2 在心血管病变中的研究进展[J].中国药理学通报，2018,34（07）：892-894.
[25] Gardiner James V,Bataveljic Attia,Patel Neekhil A et al. Prokineticin 2 is a hypothalamicneuropeptide that potently inhibits food intake.[J] .Diabetes, 2010, 59: 397-406.
[26] Baba Kenkichi,Ono Daisuke,Honma Sato et al. A TTX-sensitive local circuit is involved in theexpression of PK2 and BDNF circadian rhythms in the mouse suprachiasmatic nucleus.[J] .Eur. J.
Neurosci., 2008, 27: 909-16.
[27] Li Xiaohan,Zhang Chengkang,Zhou Qun-Yong,Overexpression of Prokineticin 2 in TransgenicMice Leads to Reduced Circadian Behavioral Rhythmicity and Altered Molecular Rhythms in theSuprachiasmatic Clock.[J] .J Circadian Rhythms, 2018, 16: 13.
[28] 汪昕，杨俊，段栩飞，黄茂华，卞红强，杨虎，朱旭。前动力蛋白 2 在炎症相关性结直肠肿瘤动物模型中的表达[J].中华实验外科杂志，2017,34（07）：1149-1151.
[29] Ren Cuixia,Qiu Chun-Yu,Gan Xiong et al. Prokineticin 2 facilitates mechanical allodynia inducedby α，β-methylene ATP in rats.[J] .Eur. J. Pharmacol., 2015, 767: 24-29.
[30] Zhao Yaguang,Wu Jiayu,Wang Xinying et al. Prokineticins and their G protein-coupled receptors inhealth and disease.[J] .Prog Mol Biol Transl Sci, 2019, 161: 149-179.
[31] Boulberdaa Mounia,Urayama Kyoji,Nebigil Canan G,Prokineticin receptor 1 （PKR1） signalling incardiovascular and kidney functions.[J] .Cardiovasc. Res., 2011, 92: 191-198.
[32] Meng Shu,Gu Qilin,Yang Xiaojie et al. TBX20 Regulates Angiogenesis Through the Prokineticin2-Prokineticin Receptor 1 Pathway.[J] .Circulation, 2018, 138: 913-928.
[33] Guilini C, Urayama K, Turkeri G, Dedeoglu DB, Kurose H, Messaddeq N, Nebigil CG. Divergentroles of prokineticin receptors in the endothelial cells: angiogenesis and fenestration[J]. Heart andcirculatory physiology. 2010, 298（3）： H844-852.
[34] D. Nam, C. W. Ni, A. Rezvan, J. Suo, K. Budzyn, A. Llanos, D. Harrison, D. Giddens, H. Jo. Partialcarotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunctionand atherosclerosis[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009, 297（4）： H1535-1543.
[35] 戴贻权，颜晓晓，刘晓如，林奕辰，陈宏宇。小鼠动脉粥样硬化模型的建立[J].中华实验外科杂志，2020（01）：172-173-174-175.
[36] 宋珂，侯彦宏，杨会，白云绮，李慧，聂波。ApoE 基因敲除小鼠疾病模型的研究进展[J].中国医药导报，2019,16（18）：42-44+48.
[37] D. Nam, C. W. Ni, A. Rezvan, J. Suo, K. Budzyn, A. Llanos, D. Harrison, D. Giddens, H. Jo. Partialcarotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunctionand atherosclerosis[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009, 297（4）： H1535-1543.
[38] Tang Ge,Duan Fengqi,Li Weixuan et al. Metformin inhibited Nod-like receptor protein 3inflammasomes activation and suppressed diabetes-accelerated atherosclerosis in apoE mice.[J] .Biomed.Pharmacother, 2019, 119: 109410.
[39] Katakami N, Yamasaki Y, Hayaishi-Okano R, Ohtoshi K, Kaneto H, Matsuhisa M, Kosugi K, HoriM. Metformin or gliclazide, rather than glibenclamide, attenuate progression of carotid intima-mediathickness in subjects with type 2 diabetes[J]. Diabetologia. 2004, 47（11）： 1906-1913.
[40] 李慧新，李凌，赵晓燕。二甲双胍对糖耐量异常患者颈动脉粥样硬化斑块的影响及其机制[J].实用医学杂志，2013,29（03）：466-468.
[41] Li CL, Pan CY, Lu JM, Zhu Y, Wang JH, Deng XX, Xia FC, Wang HZ, Wang HY. Effect ofmetformin on patients with impaired glucose tolerance[J]. Diabetic medicine. 1999, 16（6）： 477-481.
[42] Matsumoto K, Sera Y, Abe Y, Tominaga T, Yeki Y, Miyake S. Metformin attenuates progression ofcarotid arterial wall thickness in patients with type 2 diabetes[J]. Diabetes research and clinical practice.2004, 64（3）： 225-228.
[43] 曾隽，欧婕，何云美，蔡春钰。二甲双胍对 2 型糖尿病合并动脉粥样硬化患者血糖波动及动脉粥样硬化病变的影响[J].世界临床药物，2016,37（08）：551-555.
[44] 胡晓东，王旭光。二甲双胍对糖耐量异常患者血浆致动脉粥样硬化指数的影响[J].中国医疗前沿，2012,7（04）：1+27.
[45] 李松南，王祥，曾秋棠，冯义柏，郭和平，王天红，邓荷萍。二甲双胍对兔动脉粥样硬化 NF-κB 表达及血清高敏 C 反应蛋白水平的影响[J].中国病理生理杂志，2008,24（12）：2339-2343.
[46] 许庆华，陈新敬。二甲双胍对兔动脉粥样硬化血管平滑肌细胞增殖的影响[J].中国临床药理学杂志，2020,36（05）：511-513+524.
[47] Iwasa Takeshi,Matsuzaki Toshiya,Tungalagsuvd Altankhuu et al. Changes in the responsiveness ofhypothalamic PK2 and PKR1 gene expression to fasting in developing male rats.[J] .Int. J. Dev. Neurosci.,2014, 38: 87-90.
[48] Negri Lucia,Ferrara Napoleone,The Prokineticins: Neuromodulators and Mediators of Inflammationand Myeloid Cell-Dependent Angiogenesis.[J] .Physiol. Rev., 2018, 98: 1055-1082.
[49] Lichtenauer Michael,Jung Christian,TBX20 and the PROK2-PROKR1 pathway-new kid on theblock in angiogenesis research.[J] .Ann Transl Med, 2018, 6: S8.