原发性高血压与生物钟基因多态性的关系探究

　　目 录

 

　　第 1 章 引言................................................................................................................. 1

 

　　第 2 章 材料与方法..................................................................................................... 4

 

　　2.1 研究对象.......................................................................................................... 4

 

　　2.2 资料的收集............................................................................................... 4

 

　　2.3 研究对象血样的采集和 DNA 的提取............................................................5

 

　　2.3.1 研究对象血样的采集............................................................................ 5

 

　　2.3.2 DNA 的提取...........................................................................................5

 

　　2.4 SNP 位点的筛选与分型..................................................................................6

 

　　2.5 数据分析........................................................................................................ 11

 

　　2.5.1 统计分析方法...................................................................................... 11

 

　　2.5.2 质量控制方法...................................................................................... 11

 

　　第 3 章 结果............................................................................................................... 12

 

　　3.1 研究对象的基本特征................................................................................... 12

 

　　3.2 SNP 基因型分布情况....................................................................................13

 

　　3.3 各 SNP 与高血压的关联性研究...................................................................15

 

　　第 4 章 讨论............................................................................................................... 19

 

　　第 5 章 结论............................................................................................................... 22

 

　　致 谢......................................................................................................................... 23

 

　　参考文献..................................................................................................................... 24

 

　　附 录......................................................................................................................... 28

 

　　攻读学位期间的研究成果......................................................................................... 36

 

　　综 述......................................................................................................................... 37

 

　　第 1 章 引言

 

　　在全球范围内，高血压是一个严重的公共卫生问题，而且也是公认的导致人类健康下降的风险之一，甚至比烟草或高体重指数更大[1]。近几十年来，全球高血压的流行强度呈快速上升趋势，2014 年 18 岁及以上成年人血压升高的全球患病率约为 22%[2], 预计到 2025 年患病率将达到 60%，患病人数将增加至15.6 亿人[3]。我国高血压患病率也呈迅猛上升趋势，据 2018 年一项国内高血压现状调查研究显示，中国 18 岁及以上人群中有 23.2%的人（约 2.445 亿人）患有高血压，而 41.3%的人（约 4.533 亿人）患有前期高血压, 2017 年 ACC/AHA指南指出，高血压的患病率将翻一番，控制率将大幅下降[4]。另外，2017 年全球疾病负担研究结果表明，在影响全球疾病负担的危险因素中，高血压仍然位居第一位[5]。我国由高血压造成的经济和疾病负担也相当严重，与高血压相关的心血管疾病是中国成年人的主要死亡原因[6]。因此，高血压对人群健康的危害应当引起关注，而探索其高危因素，对制定原发性高血压的一级预防措施具有重大的公共卫生学意义。

 

　　原发性高血压（Essential Hypertension, EH）占总高血压人群的 95%以上，但其具体病因仍不明确，目前认为 EH 是由于先天性遗传基因与许多致病性增压因素和生理性减压因素相互作用的结果，主要包括遗传因素、高钠低钾膳食、超重和肥胖、饮酒、精神紧张、年龄、缺乏体力活动等危险因素[7]。人体每天的血压变化均遵循昼夜节律周期[8]，正常人血压在早晨时最高，下午和晚上开始降低，在睡眠后的凌晨 3 点左右达到低谷，在觉醒前的早晨 5 点后开始上升，觉醒后的早晨达到高峰，如此往复[9]。而血压的这种昼夜变化特点依赖机体内部的生物钟系统进行调节[10]。生物钟系统可分为主钟与外周钟，在哺乳动物中主钟存在于下丘脑视交叉上核（SuprachiasmaticNucleus，SCN），由此发出信息控制全身的节律活动，外周钟位于各器官组织细胞内，调控效应器的节律。SCN获得外界环境的刺激信号如（光照、睡眠等），保持机体的生理特点与行为的昼夜节律与外环境的一致[11]。生物钟系统运行的分子机制称为昼夜振荡反馈回路，其含有正性成分与负性成分，正性成分接受外界刺激（如光线、温度）启动生物钟基因，使之进行表达；而负性成分，阻断正性成分的作用，使表达减弱或停止[12]（具体机制见图 1）。其中正性成分为 CLOCK 和 ARNTL，两者可形成二聚体 CLOCK:ARNTL，CLOCK:ARNTL 通过结合 E-框驱动 per 基因（per1、per2、per3）和 cry 基因（cry1、cry2），生成 PER 与 CRY 蛋白，两者亦可形成 PER:CRY复合物，转移至细胞核内，作为哺乳动物昼夜振荡反馈回路的负性调节成分抑制 CLOCK 和（或）ARNTL 的转录。CLOCK:ARNTL 同时也可促进 NR1D1 转录（Rev-Erbα），但 NR1D1 浓度的升高反之也可抑制 ARNTL 的转录。这个核心的环路与其他的正负反馈环路相结合，如 RORα(RAR- related orphan receptorα)、REV-ERBα (NR1D1, nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)等蛋白参与的反馈环路，共同构成昼夜节律的调控通路。同时，这些时钟基因还调控一些下游基因(也被称为钟控基因)的表达，从而调节各种生理和生命活动的昼夜节律[13]。

 

　　
图 1 体内生物钟昼夜反馈回路。

 

　　（摘自 Nature.2002;418(6901):935-941）
 

         近年来，基因多态性与疾病的关系引起了人们的关注，大量动物试验均表明，基因表达改变均会影响血压的昼夜周期性，引起高血压或低血压。与正常　　野生大鼠相比，高血压大鼠体内 CLOCK 基因表达增高[14]。平滑肌 ARNTL 基因敲除小鼠模型显示，其血压水平下降，血压昼夜变化幅度也下降[15]。而且在人群的研究中 CLOCK 基因与高血压和糖尿病相关[16]。因此生物钟系统基因在维持机体血压的昼夜节律起到至关重要的作用。

 

　　虽然生物钟基因与高血压联系在动物实验中得到证实，但在人群流行病学研究中，鲜有报道生物钟基因多态性与 EH 的关系。目前仅有一篇关于生物种基因多态性与青少年非杓型高血压相关，但是其样本含量仅 372 例[17]。另外，单核苷酸多态性(SNPs)是指在基因组上单个核苷酸的变异所形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富因，是目前倍受关注的一类多态性[18]。单核苷酸多态性是基因组内特定核苷酸位置上的两种不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于 1%[19,20]。SNPs 包括单碱基的互换、转换以及单碱基的插入、缺失等，遍布整个基因组，在基因多态性研究、基因图谱构建、疾病诊断、预防和药物筛选的研究中具有重要作用[21]。

 

　　综上所述，本研究从人群基因易感性角度出发，假设人体内生物钟通路相关基因多态性可能引起血压昼夜节律变化，从而增加 EH 的发生风险。拟采用以社区为基础的病例-对照研究，运用分子生物学技术检测发挥主要作用时钟基因的基因型，探索生物钟分子系统关键基因多态性对人群 EH 发生的影响，预期结果可为 EH 的一级预防提供科学依据。
 

　　本研究引物的设计与合成及基因 SNP 的分型将外包给商业公司完成。同时随机抽取 5%的样本验证基因分型的正确性。

 

　　2.5 数据分析

 

　　2.5.1 统计分析方法

 

　　对于连续变量，如年龄，身高等采用 t 检验进行统计分析；对于分类变量，如性别，职业等采用χ2 检验进行分析。

 

　　单个 SNP 与 EH 的易感性分析。采用 Pearson χ2 检验比较各 SNP 基因型在病例和对照中的分布差异。考虑到多重假设检验可能增加假阳性的概率，采用FDR 方法进行多重校正。FDR 方法：首先按 P 值由小到大进行排次，各 P 值分别乘以其对应的系数(位点个数除以该 P 值的位次)，即最小的 P 值乘以位点个数，而最大的 P 值保持不变。另外，采用非条件 Logistic 回归分析候选 SNPs在 EH 发病风险关系，并校正性别、年龄、吸烟及饮酒等混杂因素，分别计算杂合子、纯合子、显性模型、隐性模型及加性模型的调整 OR 及 95%CI。

 

　　2.5.2 质量控制方法

 

　　①查前对所有调查员集中进行统一培训：现场调查过程中由质控员核查全部体检表和调查问卷的完整性，并抽取其中 1%的部分复核其有效性和完整性；利用 Epidata3.0 软件在数据录入过程中进行平行双录入，同时设置逻辑核查。

 

　　②DNA 提取中所有试剂及耗材均经过严格消毒，保证 DNA 不被污染。基因分型过程中，实验人员对于样本的来源是单盲的，即检测人员不知道样本是来源于病例还是对照。随机抽取了 5%的平行样本进行重复实验，并以去离子水设置阴性对照，以验证分型结果的可靠性。③检测对照组中各 SNP 基因型分布是否满足 Hardy-Weinberg 平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)，若经错误发现率(False discovery rate,FDR)方法进行多重校正后的 P 值<0.05，表明该位点严重偏离 HWE，则不纳入统计分析过程。

 

　　第 3 章 结果

 

　　3.1 研究对象的基本特征

 

　　本研究共纳入研究对象 1582 例，剔除暴露因素或其他待调整协变量的有缺失的对象共 64 例，本次分析共纳入研究对象 1518 例，其中高血压 550 例（36.2%），正常血压为 968 例（63.8%）。如表 3 所示为高血压（病例组）和正常血压（对照组）者的一般特征比较情况。与对照组相比高血压患者中男性比例较大，有高血压家族史和糖尿病家族史，年龄较大，家庭年平均收入较低，吸烟、食盐、饮酒和喝茶的情况者患病率较高（P<0.05）。高血压患者的 BMI、腰臀比和体力活动显着高于对照组(P<0.05)。

 

　　表 3 研究对象一般人口学特征、家族史及生活方式分布