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原发性高血压与生物钟基因多态性的关系探究

来源:南昌大学 作者:李来芳
发布于:2020-08-26 共16444字
  摘 要
 
  目的:从人群基因易感性角度出发,探讨生物钟分子系统中关键基因多态性对人群原发性高血压(Essential hypertension,EH)发生的影响。
 
  方法:本研究采用病例-对照研究方法,通过自制的结构式调查问卷获取研究对象的一般情况资料,通过公共数据库 SNP info 筛选候选基因和功能性 SNP位点,候选SNPs分型采用Sequenom MassARRAY分子量阵列技术平台的iPLEXGOLD 技术系统(Sequenom)完成。采用 Pearson χ2 检验比较各 SNP 基因型在病例和对照中的分布差异。另外,采用非条件 Logistic 回归分析候选 SNPs 与 EH发病风险关系,并校正性别、年龄,分别计算纯合子、杂合子、显性模型、隐性模型及加性模型的调整 OR 及 95%CI。
 
  结果:rs17060415 (RORB,RAR-related orphan receptor B)位点,以野生纯合子为参比组(TT), 突变纯合子CC携带者增加EH的发生风险 (OR=1.7, 95%CI:
 
  1.1, 2.64),显性模型中,携带 T 位点相对于 C 位点,可降低高血压风险(OR=0.59,95%CI: 0.38, 0.9)。隐性模型中,rs4795424 (NR1D1, Nuclear receptor subfamily 1,group D, member 1)(A vs C, OR=0.75, 95%CI:0.58, 0.98), rs3027178 (PER1, PeriodCircadian Regulator 1) (G vs T, OR=0.78,95%CI:0.61, 0.99), rs4376556 (RORB) (Avs G, OR=0.60, 95%CI: 0.41, 0.86), rs7846903 (RORB) (A vs G, OR=0.60, 95%CI:
 
  0.41, 0.87), rs9017(RORC, RAR-related orphan receptor C ) (T vs C, OR=0.77,95%CI: 0.60, 0.99) 位 点 与 EH 负 相 关 。 rs228729 (PER3, Period CircadianRegulator 3)与 EH 正相关 (T vs C, OR=1.30, 95%CI:1.02, 1.65)。加性模型中,rs4376556, rs7846903 及 rs9017 依然与 EH 负相关。
 
  结 论 : RORB-rs17060415 位 点 的 遗 传 变 异 会 增 加 EH 的 发 病 风 险 ;Per3-rs228729 位 点 与 EH 的 发 病 风 险 呈 正 相 关 , 而 RORB-rs4376556 、RORB-7846903、RORC-rs9017、NR1D1-rs4795424 和 Per-rs3027178 位点与 EH的发病风险呈负相关。
 
  关键词:原发性高血压;生物钟基因;单核苷酸多态性
 
 ABSTRACT
 
  Objective: To explore the effect of circadian clock gene polymorphisms on theoccurrence of essential hypertension(EH) in the population from the perspective ofpopulation genetic susceptibility.
 
  Methods: This study employed a case-control research method, obtainedgeneral information of the research subjects through a structured questionnaire, andcandidate genes and functional SNP sites were selected through the public databaseSNP info. Genotyping were performed on the iPLEX GOLD technology system(Sequenom) of the Sequenom MassARRAY molecular weight array technologyplatform. Pearsonχ2test was used to compare the distribution of each SNP genotypein cases and controls.In addition, non-conditional logistic regression was used toanalyze the relationship between candidate SNPs and the risk of EH. At the sametime, potential confounders such as gender, age, smoking, and drinking wereadjusted. and the adjusted OR and 95%CI of homozygotes, heterozygotes, dominantmodels, recessive models, and additive models were calculated.
 
  Results: Compared with wild homozygote (TT), the rs17060415 (RORB,RAR-related orphan receptor B) locus increased the risk of EH (OR = 1.7, 95%CI:
 
  1.1, 2.64). In the model, carrying the T site might reduce the risk of EH (OR = 0.59,95%CI: 0.38, 0.9) comparing with the C site. In the recessive model, rs4795424(NR1D1, Nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1) (A vs C, OR = 0.75,95%CI: 0.58, 0.98), rs3027178 (PER1, Period Circadian Regulator 1) (G vs T, OR =0.78, 95%CI: 0.61, 0.99), rs4376556 (RORB) (A vs G, OR = 0.60, 95%CI: 0.41,0.86), rs7846903 (RORB) (A vs G, OR = 0.60, 95%CI: 0.41, 0.87), rs9017 (RORC,RAR-related orphan receptor C) (T vs C, OR=0.77, 95%CI: 0.60, 0.99) loci werenegatively correlated with EH, rs228729 (PER3, Period Circadian Regulator 3) waspositively correlated with EH (T vs C, OR = 1.30, 95%CI: 1.02, 1.65). In theadditive model, rs4376556,rs7846903, and rs9017 were still negatively correlatedwith EH.
 
  Conclusion: The genetic variation of the RORB-rs17060415 locus increases therisk of EH. Per3-rs228729 was positively correlated with the risk of EH, whileRORB-rs4376556, RORB-7846903, RORC-rs9017, NR1D1-rs4795424, andPer-rs3027178 were negatively associatedwith the risk of EH.
 
  Key Words: Essential hypertension; Circadian rhythm gene; Single nucleotidepolymorphism

  目 录
 
  第 1 章 引言................................................................................................................. 1
 
  第 2 章 材料与方法..................................................................................................... 4
 
  2.1 研究对象.......................................................................................................... 4
 
  2.2 资料的收集............................................................................................... 4
 
  2.3 研究对象血样的采集和 DNA 的提取............................................................5
 
  2.3.1 研究对象血样的采集............................................................................ 5
 
  2.3.2 DNA 的提取...........................................................................................5
 
  2.4 SNP 位点的筛选与分型..................................................................................6
 
  2.5 数据分析........................................................................................................ 11
 
  2.5.1 统计分析方法...................................................................................... 11
 
  2.5.2 质量控制方法...................................................................................... 11
 
  第 3 章 结果............................................................................................................... 12
 
  3.1 研究对象的基本特征................................................................................... 12
 
  3.2 SNP 基因型分布情况....................................................................................13
 
  3.3 各 SNP 与高血压的关联性研究...................................................................15
 
  第 4 章 讨论............................................................................................................... 19
 
  第 5 章 结论............................................................................................................... 22
 
  致 谢......................................................................................................................... 23
 
  参考文献..................................................................................................................... 24
 
  附 录......................................................................................................................... 28
 
  攻读学位期间的研究成果......................................................................................... 36
 
  综 述......................................................................................................................... 37
 
  第 1 章 引言
 
  在全球范围内,高血压是一个严重的公共卫生问题,而且也是公认的导致人类健康下降的风险之一,甚至比烟草或高体重指数更大[1]。近几十年来,全球高血压的流行强度呈快速上升趋势,2014 年 18 岁及以上成年人血压升高的全球患病率约为 22%[2], 预计到 2025 年患病率将达到 60%,患病人数将增加至15.6 亿人[3]。我国高血压患病率也呈迅猛上升趋势,据 2018 年一项国内高血压现状调查研究显示,中国 18 岁及以上人群中有 23.2%的人(约 2.445 亿人)患有高血压,而 41.3%的人(约 4.533 亿人)患有前期高血压, 2017 年 ACC/AHA指南指出,高血压的患病率将翻一番,控制率将大幅下降[4]。另外,2017 年全球疾病负担研究结果表明,在影响全球疾病负担的危险因素中,高血压仍然位居第一位[5]。我国由高血压造成的经济和疾病负担也相当严重,与高血压相关的心血管疾病是中国成年人的主要死亡原因[6]。因此,高血压对人群健康的危害应当引起关注,而探索其高危因素,对制定原发性高血压的一级预防措施具有重大的公共卫生学意义。
 
  原发性高血压(Essential Hypertension, EH)占总高血压人群的 95%以上,但其具体病因仍不明确,目前认为 EH 是由于先天性遗传基因与许多致病性增压因素和生理性减压因素相互作用的结果,主要包括遗传因素、高钠低钾膳食、超重和肥胖、饮酒、精神紧张、年龄、缺乏体力活动等危险因素[7]。人体每天的血压变化均遵循昼夜节律周期[8],正常人血压在早晨时最高,下午和晚上开始降低,在睡眠后的凌晨 3 点左右达到低谷,在觉醒前的早晨 5 点后开始上升,觉醒后的早晨达到高峰,如此往复[9]。而血压的这种昼夜变化特点依赖机体内部的生物钟系统进行调节[10]。生物钟系统可分为主钟与外周钟,在哺乳动物中主钟存在于下丘脑视交叉上核(SuprachiasmaticNucleus,SCN),由此发出信息控制全身的节律活动,外周钟位于各器官组织细胞内,调控效应器的节律。SCN获得外界环境的刺激信号如(光照、睡眠等),保持机体的生理特点与行为的昼夜节律与外环境的一致[11]。生物钟系统运行的分子机制称为昼夜振荡反馈回路,其含有正性成分与负性成分,正性成分接受外界刺激(如光线、温度)启动生物钟基因,使之进行表达;而负性成分,阻断正性成分的作用,使表达减弱或停止[12](具体机制见图 1)。其中正性成分为 CLOCK 和 ARNTL,两者可形成二聚体 CLOCK:ARNTL,CLOCK:ARNTL 通过结合 E-框驱动 per 基因(per1、per2、per3)和 cry 基因(cry1、cry2),生成 PER 与 CRY 蛋白,两者亦可形成 PER:CRY复合物,转移至细胞核内,作为哺乳动物昼夜振荡反馈回路的负性调节成分抑制 CLOCK 和(或)ARNTL 的转录。CLOCK:ARNTL 同时也可促进 NR1D1 转录(Rev-Erbα),但 NR1D1 浓度的升高反之也可抑制 ARNTL 的转录。这个核心的环路与其他的正负反馈环路相结合,如 RORα(RAR- related orphan receptorα)、REV-ERBα (NR1D1, nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)等蛋白参与的反馈环路,共同构成昼夜节律的调控通路。同时,这些时钟基因还调控一些下游基因(也被称为钟控基因)的表达,从而调节各种生理和生命活动的昼夜节律[13]。
 
  
图 1 体内生物钟昼夜反馈回路。
 
  (摘自 Nature.2002;418(6901):935-941)
 
         近年来,基因多态性与疾病的关系引起了人们的关注,大量动物试验均表明,基因表达改变均会影响血压的昼夜周期性,引起高血压或低血压。与正常  野生大鼠相比,高血压大鼠体内 CLOCK 基因表达增高[14]。平滑肌 ARNTL 基因敲除小鼠模型显示,其血压水平下降,血压昼夜变化幅度也下降[15]。而且在人群的研究中 CLOCK 基因与高血压和糖尿病相关[16]。因此生物钟系统基因在维持机体血压的昼夜节律起到至关重要的作用。
 
  虽然生物钟基因与高血压联系在动物实验中得到证实,但在人群流行病学研究中,鲜有报道生物钟基因多态性与 EH 的关系。目前仅有一篇关于生物种基因多态性与青少年非杓型高血压相关,但是其样本含量仅 372 例[17]。另外,单核苷酸多态性(SNPs)是指在基因组上单个核苷酸的变异所形成的遗传标记,其数量很多,多态性丰富因,是目前倍受关注的一类多态性[18]。单核苷酸多态性是基因组内特定核苷酸位置上的两种不同碱基,其中最少一种在群体中的频率不小于 1%[19,20]。SNPs 包括单碱基的互换、转换以及单碱基的插入、缺失等,遍布整个基因组,在基因多态性研究、基因图谱构建、疾病诊断、预防和药物筛选的研究中具有重要作用[21]。
 
  综上所述,本研究从人群基因易感性角度出发,假设人体内生物钟通路相关基因多态性可能引起血压昼夜节律变化,从而增加 EH 的发生风险。拟采用以社区为基础的病例-对照研究,运用分子生物学技术检测发挥主要作用时钟基因的基因型,探索生物钟分子系统关键基因多态性对人群 EH 发生的影响,预期结果可为 EH 的一级预防提供科学依据。
 
  第 2 章 材料与方法
 
  2.1 研究对象
 
  根据江西省九江市城区社区卫生服务中心居民健康系统(九江市浔阳区甘棠街道社区卫生服务中心及九江市庐山区五里街道社区卫生服务中心), 病例组研究对象来源于以上两个城市社区(江西省九江地区)常住居民 2016 年 1 月1 日至 2018 年 12 月 31 日期间新诊断的 EH 患者,病例组纳入标准为:①为 EH患者,所有诊断均符合《中国高血压防治指南 2010》,即在未使用降压药物的情况下,非同日 3 次测量血压,收缩压(SBP)≥140mmHg 和(或)舒张压(DBP)≥90mmHg;或正在使用抗高血压药物,排除继发性高血压、睡眠呼吸暂停综合征、陈旧性心肌梗死,慢性心功能不全,主动脉瓣关闭不全,风湿性心脏病、心肌病、肺心病、重度贫血、痛风,甲状腺功能亢进及严重肝肾疾病等患者。
 
  ②年龄介于 18-75 岁之间。③民族为汉族。
 
  对照组要求为:①SBP≤140mmHg,DBP≤90mmHg,且无血缘关系,排除冠心病,糖尿病,肿瘤,肝肾功损害者等,②年龄介于 18-75 岁之间。③民族为汉族。具体为在患者居住地附近地区,以门牌号同为奇数或者偶数的方法,选取满足条件的邻居为对照。如本研究中某新发原发高血压患者的门牌号为1520,则首先寻找门牌号为 1522 的住户,确定是否满足条件、是否自愿参加本项目,若未能找到适合的对照,则继续寻找门牌号为 1524 的住户,以此类推,直到找到适宜的匹配对照为止。
 
  伦理学问题:本研究调查人员负责对所有研究对象解释相关研究目的与意义,征得研究对象的同意,并与之签署知情同意书后进行面访并采取生物学标本,所有研究对象的个人信息做到绝对保密。
 
  2.2 资料的收集
 
  本次相关协变量的收集均是通过自制的结构式调查问卷(见附录 A)获取。
 
  调查问卷涉及到 4 个方面的内容:①人口学资料。包括职业、年龄、家庭经济收入等;②身体测量指标。包括体重、身高、血压值、腰臀围等;③慢性疾病(包括肿瘤)史、慢性疾病(包括肿瘤)家族史以及相关用药史等;④体力活动。采用体力活动调查问卷获取,除了职业性体力活动以外,调查内容还包括平时的体育锻炼,上下班骑自行车、步行或上下楼梯等,回忆期也为 1 年。调查表均由质量控制人员进行逻辑纠错,对出现逻辑或填写错误的选项及时纠正,所有资料使用 Epidata 3.1 进行双录入实时校验,保证录入的准确性。
 
  2.3 研究对象

        血样的采集和 DNA 的提取2.3.1 研究对象血样的采集在研究对象知情同意的情况下,采取外周静脉血 2ml,置于肝素抗凝管内,充分混匀,并在 6h 内送往“九江学院基础医学院精准预防医学实验室”进行处理与分装,对血液样本 1500rpm 离心 10min,分离血浆与血细胞,每管 500ul分装,置于-80℃冰箱保存。
 
  2.3.2 DNA 的提取
 
  2.3.2.1 主要仪器设备及试剂
 
  移液器(Eppendoff 公司)、5810R 低温高速离心机(Eppendoff 公司),恒温水浴锅(上海新苗医疗器械制造有限公司),Nano Drop1000 紫外-可见光分光光度计(Thermo 公司)。
 
  DP319-02 血液基因组 DNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)2.3.2.2 DNA 提取的主要步骤DNA 提取的准备工作:高压灭菌干燥好的的枪头(1000μL 和 200μL);异丙醇和无水乙醇等常规试剂,并用无水乙醇和去离子蒸馏水配制 75%的乙醇溶液。本研究全血 DNA 提取采用北京天根血液基因组 DNA 提取试剂盒(非离心柱型,DP319-02),严格遵循说明书规范操作。基本操作包括裂解、消化、沉淀、漂洗和溶解五步,具体操作详见参考文献[22]。
 
  2.3.3 DNA 浓度及纯度测定
 
  利用 Nano Drop1000 紫外-可见光分光光度计进行微量核算测定,以检测样本的浓度与纯度。其基本原理是:DNA 链上的脱氧核糖核苷酸的苯环结构吸收6峰在 260nm 处,而 蛋 白 质 和 酚 类 物 质 最 高 吸 收 峰 在 280nm ,所 以 ,一 般 用 OD260nm/OD280nm 比值用来衡量样品的纯度(纯 DNA 的比值为 1.8,纯 RNA 为 2.0),如比值<1.6,说明受到蛋白质或酚类的污染,比值>2.0,说明有 RNA 污染,需要纯化样品。碳水化合物最高吸收峰在 230nm,用 OD230nm 代表碳水化合物的吸光度。 纯 DNA 的 OD260nm/OD230nm 比值为 2.5,若比值<2.0 表示有碳水化合物污染,需要纯化样品。在实际操作中,DNA 浓 度 大 于 25ng/μL 且 OD260nm/OD280nm 比值在 1.6-2.0 之间,OD260nm/OD230nm>2.0 为合格样本。Nano Drop1000 具体的使用方法和操作详见参考文献[23]。
 
  2.4 SNP 位点的筛选与分型
 
  利用 Gene Cards(https://www.genecards.org/)查询与高血压相关的核心时钟基因,共筛选出包括 ARNTL、CLOCK、CRY1、CRY2、CSNK1D、NR1D1、PER1、PER2、PER3、RORA、RORB、RORC 等 12 个基因,利用 SNPinfo(https://snpinfo.niehs.nih.gov/)等多个公共数据库资源和预测软件,并结合连锁不平衡分析, 进行对上述基因的潜在的功能性结合位点(如转录因子结合位点)的筛选,选择在中国北方汉族居民(Han Chinese in Beijing,CHB)中最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)>0.1 的位点。
 
  分析后共获取到标签 SNP 位点 55 个,包括 ARNTL (rs2279284, rs2279285,rs2279286, rs2279287, rs1048004),CLOCK (rs11133399, rs1801260, rs2070062,rs3749474, rs4864548), CRY1(rs1056560, rs10861687, rs3809235, rs3809236,rs8192433), CRY2(rs2292910, rs3824872, rs6798), CSNK1D(rs3829773, rs4789846),NR1D1(rs2071570, rs4795424, rs939347), PER1 (rs2518023, rs2585408, rs2735611,rs3027171, rs3027178, rs6416892), PER2 (rs2304669, rs2304672, rs934945), PER3(rs228669, rs228729, rs2640908), RORA (rs10431795, rs10431796, rs7165792),RORB (rs10869406, rs11144064, rs17060415, rs2273975, rs4376556, rs7846903),RORC (rs10494269, rs11588258, rs11588634, rs12045886, rs12126984, rs1521177,rs3811417, rs3828057, rs4845606, rs9017, rs9826)。各个 SNP 位点的基本信息与功能见表 1 及表 2。
 
  表 1 SNP 位点的基本信息
 


续表

  
注: MAF, 最小等位基因频率。CHB,中国北方汉族。
 
  表 2 SNPinfo 数据库对候选 SNPs 的功能注释
 

续表


续表



  注:TFBS, 转录因子结合位点;ESE or ESS,外显子剪切/沉默子;nsSNP, 非同义突变;Mi RNA,Micro RNA 结合位点。
 
  候选 SNPs 分型采用 Sequenom MassARRAY 分子量阵列技术平台的 iPLEXGOLD 技术系统(Sequenom)完成。MassARRAY 分子量阵列技术平台是一种用于基因组定性、定量分析的可扩展性的技术平台。MassARRAY 采用质谱法原理直接检测 SNP,不需要对探针进行荧光标记,因此检测过程不受荧光物质的干扰,另外 MassARRAY 反应体系不依赖于杂交,因此可以避免杂交错配的干扰,准确性可靠。该方法以 384 孔板的形式进行反应,每次反应最高同时可检测一个样本的 40 个位点,既满足了目前的常见中小规模的科研需要,也在提高通量的同时大大降低了试剂损耗,节约成本。

  本研究引物的设计与合成及基因 SNP 的分型将外包给商业公司完成。同时随机抽取 5%的样本验证基因分型的正确性。
 
  2.5 数据分析
 
  2.5.1 统计分析方法
 
  对于连续变量,如年龄,身高等采用 t 检验进行统计分析;对于分类变量,如性别,职业等采用χ2 检验进行分析。
 
  单个 SNP 与 EH 的易感性分析。采用 Pearson χ2 检验比较各 SNP 基因型在病例和对照中的分布差异。考虑到多重假设检验可能增加假阳性的概率,采用FDR 方法进行多重校正。FDR 方法:首先按 P 值由小到大进行排次,各 P 值分别乘以其对应的系数(位点个数除以该 P 值的位次),即最小的 P 值乘以位点个数,而最大的 P 值保持不变。另外,采用非条件 Logistic 回归分析候选 SNPs在 EH 发病风险关系,并校正性别、年龄、吸烟及饮酒等混杂因素,分别计算杂合子、纯合子、显性模型、隐性模型及加性模型的调整 OR 及 95%CI。
 
  2.5.2 质量控制方法
 
  ①查前对所有调查员集中进行统一培训:现场调查过程中由质控员核查全部体检表和调查问卷的完整性,并抽取其中 1%的部分复核其有效性和完整性;利用 Epidata3.0 软件在数据录入过程中进行平行双录入,同时设置逻辑核查。
 
  ②DNA 提取中所有试剂及耗材均经过严格消毒,保证 DNA 不被污染。基因分型过程中,实验人员对于样本的来源是单盲的,即检测人员不知道样本是来源于病例还是对照。随机抽取了 5%的平行样本进行重复实验,并以去离子水设置阴性对照,以验证分型结果的可靠性。③检测对照组中各 SNP 基因型分布是否满足 Hardy-Weinberg 平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE),若经错误发现率(False discovery rate,FDR)方法进行多重校正后的 P 值<0.05,表明该位点严重偏离 HWE,则不纳入统计分析过程。
 
  第 3 章 结果
 
  3.1 研究对象的基本特征
 
  本研究共纳入研究对象 1582 例,剔除暴露因素或其他待调整协变量的有缺失的对象共 64 例,本次分析共纳入研究对象 1518 例,其中高血压 550 例(36.2%),正常血压为 968 例(63.8%)。如表 3 所示为高血压(病例组)和正常血压(对照组)者的一般特征比较情况。与对照组相比高血压患者中男性比例较大,有高血压家族史和糖尿病家族史,年龄较大,家庭年平均收入较低,吸烟、食盐、饮酒和喝茶的情况者患病率较高(P<0.05)。高血压患者的 BMI、腰臀比和体力活动显着高于对照组(P<0.05)。
 
  表 3 研究对象一般人口学特征、家族史及生活方式分布


  
注:SD(standard deviation),标准差;n(number of subjects in category),每组样本含量; BMI(body mass index):体重指数;METs (metabolic equivalent):代谢当量。
 
  3.2 SNP 基因型分布情况
 
  本研究共挑选生物钟通路相关基因功能性 SNP 位点 55 个,除 rs2279286、rs939347 外、其余 SNPs 检出率均超过 95%。经哈迪温伯格平衡检验,7 个 SNP(rs11133399, rs3809235, rs3824872, rs939347, rs11588258, rs12045886, rs3027171)不符合哈迪温伯格平衡,如表 4 所示,有 48 个 SNP 位点被纳入后续的研究,其中有 5 个位于 ARNTL 上,4 个位于 CLOCK 上,4 个位于 CRY1 上,2 个位于CRY2 上,2 个位于 CSNK1D 上,2 个位于 NR1D1 上,5 个位于 PER1 上,3 个位于 PER2 上,3 个位于 PER3 上,3 个位于 RORA 上,6 个位于 RORB 上,9个位于 RORC 上。另外发现,RORB 上的 rs2273975、rs4376556 和 rs7846903位点的三种基因型在病例组和对照组中的分布差异有统计学意义(P=0.027、P=0.021、P=0.022)。
 
  表 4 各 SNPs 分布情况



续表

  注:SNP,单核苷酸多态性;HWE,哈迪温伯格平衡检验。HW(Wild homozygous),野生纯合子。HT(Heterozygote),杂合子。HV(Mutant homozygote),突变纯合子。
 
  3.3 各 SNP 与高血压的关联性研究
 
  将每个 SNPs (剔除不符合哈迪温伯格平衡的 SNPs7 个) 作为单独暴露因素,分析各个 SNPs 与原发性高血压之间的关联。rs17060415 (RORB)位点,以野生纯合子为参比组(TT), 突变纯合子 CC 携带者升高原发性高血压的发生风险(OR=1.7, 95%CI: 1.1, 2.64),显性模型中,携带 T 位点相对于 C 位点,可降低高血压风险(OR=0.59, 95%CI: 0.38, 0.9)。隐性模型中,rs4795424 (NR1D1)(A vsC, OR=0.75, 95%CI:0.58, 0.98), rs3027178 (PER1) (G vs T, OR=0.78, 95%CI:0.61,0.99), rs4376556 (RORB) (A vs G, OR=0.60, 95%CI: 0.41, 0.86), rs7846903 (RORB)(A vs G, OR=0.60, 95%CI: 0.41, 0.87), rs9017(RORC) (T vs C, OR=0.77, 95%CI:
 
  0.60, 0.99) 位点与原发性高血压负相关。 rs228729 (PER3)与原发性高血压正相关 (T vs C, OR=1.30, 95%CI:1.02, 1.65)。加性模型中,rs4376556, rs7846903及 rs9017 依然与原发性高血压负相关。对各个模型的 P 值进行 FDR 校正,P值均无统计学意义,详见表 5。

表 5 各 SNP 与高血压的关联性研究



注:各模型均校正年龄、性别、吸烟及饮酒。
  
第 4 章 讨论
 
  目前相关文献报道:分子生物钟是一个具有协调人类生物学和外部环境基本功能的生物网络,它会影响我们的活动,体温,情绪,血压和激素分泌,使其呈现出昼夜节律的特征[24,25]。在哺乳动物中,现已发现包括 Clock(circadianlocomotor output cycles kaput)、Bmal1(Brain and muscle aryl-hydrocarbon receptornuclear translocator-like 1)、 Per(Period)和 Cry(Cryptochrome)等发挥主要作用的时钟基因及其相关蛋白产物,他们共同组成一系列的正负反馈通路[26]。尤其是在具有昼夜节律特征的哺乳动物的血压调节上,人类的血压会在醒来时快速上升,然后在早上 10 点左右会达到高峰。与此同时,这些变化与临床疾病事件发生的昼夜变化相吻合,包括心肌梗塞和中风,心源性猝死,血管成形术后的再狭窄和主动脉瘤破裂[27]。近年来,生物钟基因与高血压的联系在动物试验中也得到了证实,几个核心时钟基因被报道以不同的方式来调节血压的高低,例如,小鼠体内 Bmal1 的缺失会导致其血压昼夜节律的消除,还可导致低血压的发生,小鼠的收缩压以及舒张压比野生型小鼠大约都降低 10mm Hg,儿茶酚胺的产生减少被认为是其发生的可能机制[28,29]。Per1 和 Per2 的缺失也对小鼠血压节律具有同样类似的影响[30,31,32],但是小鼠 cry 基因的突变破坏压力反射会导致盐敏性的高血压的出现,表现为高水平的醛固酮[33];醛固酮的增加是由于肾上腺增生性肾小球中受时钟控制的 3-b-羟类固醇脱氢酶 1(3b-Hsd1 生物合成酶的过度表达引起的[34]。另外一些时钟基因还会调控一些下游基因的表达,进而去调节各种生命和生理活动的发生[11,35,36]。由此可见,生物钟对血压的调节发挥着至关重要的作用,与疾病的发生发展有着极其复杂的关联。相关研究结果显示,当生物钟基因发生突变、缺失等时,有关血压疾病的发生发展都会受到不同程度的影响,但目前多数研究只是探索生物钟基因对血压影响的复杂功能,从遗传易感性的角度出发,关注生物钟基因改变所引起原发性高血压的直接关联性的研究还比较少。因此,本研究从人群基因易感性角度出发,运用分子学生物技术检测生物钟基因的基因型,来探讨生物钟基因多态性在 EH 发生中的作用。
 
  近年来,基因多态性与疾病之间联系的研究引起了人们的关注。2019 年的一篇综述中,21 个基因的多态性变异被鉴定出与原发性高血压有相关[37]。基因多态性是指在一个生物群体中,同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因,也称为遗传多态性[38]。其中,人类基因组中最常见的变异类型就是单核苷酸多态性(SNPs)[39]。其中很大一部分对人类疾病有着直接的影响,通过候选基因以及全基因组关联研究(GWAS),已鉴定出与多种复杂疾病有关的SNPs[40-42]。也有研究为某些钟基因的突变可以引起血压的变化,从而引发高血压相关疾病提供了理论依据[43]。所以从功能的角度来看,识别位于不同基因中较不常见的 SNPs 等位基因的生物学作用至关重要[44]。此外,它将有助于去鉴别某些个体对某些药物或生物疗法是否有反应,以此来解释是否存在遗传学方面的因素[45-46]。
 
  那么,我们的研究即是进行的一项遗传学关联研究,对 11 个与生物钟相关的基因共 55 个标记单核苷酸多态性(SNPs)进行基因分型,分析其与血压变化的相关性。Eugene Lin 等的研究提示了 RORB、RORC 与血压调节有着名义关联[47]。本研究结果显示 RORB 的 rs17060415 位点,以野生纯合子为参比组(TT), 突变纯合子 CC 携带者升高原发性高血压的发生风险(OR=1.7,95%CI: 1.1,2.64),在显性模型中,携带 T 位点相对于 C 位点,能够降低高血压风险(OR=0.59,95%CI:0.38,0.9) 。 在 隐 性 模 型 中 , rs4376556(RORB)(AvsG,OR=0.60,95%CI:
 
  0.41,0.86),rs7846903(RORB)(AvsG,OR=0.60,95%CI:0.41,0.87),rs9017(RORC)(TvsC,OR=0.77,95%CI:0.60,0.99) 位点与原发性高血压负相关。在加性模型中,rs4376556,rs7846903 及 rs9017 依然与原发性高血压负相关,即随着 A 等位基因的增加,高血压发生风险也降低。现有研究表明在小鼠模型中,Per1 的缺失与预防其高血压有关[48],Tianfei Hou 等人的研究也显示 Per2 在小鼠血压昼夜紊乱中起着作用[49]。本研究结果表明,隐性模型中,rs3027178 (PER1) (G vs T,OR=0.78, 95%CI:0.61, 0.99)位点与原发性高血压负相关,rs228729 (PER3)与原发性高血压正相关 (TvsC,OR=1.30, 95%CI:1.02,1.65)。另外,在隐性模型中我们发现 rs4795424 (NR1D1)(A vs C, OR=0.75, 95%CI:0.58, 0.98)位点与原发性高血压负相关。我们的研究无疑为 Per、NR1D1 基因与人类血压的关联性提供了新的证据。
 
  当然,本研究也存在一些局限性,病例对照方法是进行遗传关联分析的一种常见的方法,不需要相关性,只需要一个“匹配”的对照组,这种方法越来越多地被用于大规模的遗传研究(如 GWAS、外显子组或全基因组测序)[50]。
 
  但是方法面临的挑战之一就是研究过程中的偏倚问题,尤其是对于高血压这样的疾病,因为所谓的这种“疾病”其实是一种“综合征”,但在医疗过程中却被记录为一种疾病,即选择偏倚。其他挑战包括人口分层和设置对照组。设置对照组是高血压遗传学中的一个主要问题,因为对照组需要有血压始终正常的个体组成,这是比较难控制的目标。另外,基因多态性变异与表型关联之间可能存在统计学证据,即变异的本身可能直接影响形状或表型。也可能归因于紧密相关的致命等位基因或存在连锁不平衡,偶然或假象等现象。在未来的研究中需要进一步控制这些问题的出现,尤其对于人口分层,可以进行更为细致的划分,从而能够得出更为精确的结论。
…………由于本文篇幅较长,部分内容省略,详细全文见文末附件
 
  第 5 章 结论
 
  总之,本研究从人群基因易感性角度出发,运用分子生物学技术检测生物钟基因的基因型,探讨生物钟关键基因多态性与 EH 的关联作用。研究发现RORB-rs17060415 位 点 的 遗 传 变 异 会 升 高 原 发 性 高 血 压 的 发 病 风 险 。
 
  Per3-rs228729 位 点 与 EH 的 发 病 风 险 呈 正 相 关 , 而 RORB-rs4376556 、RORB-7846903、RORC-rs9017、NR1D1-rs4795424 和 Per-rs3027178 位点与 EH的发病风险呈负相关。
 
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作者单位:南昌大学
原文出处:李来芳. 生物钟基因多态性与原发性高血压的关联性研究[D].南昌大学,2020.
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