转基因成分功能核酸生物传感器综述

　　摘    要：　转基因技术在全球范围内引起了极大的关注，转基因成分，尤其是转基因作物，关乎人体健康和生态环境，备受世人关注，并且引发了一系列伦理道德问题，因此对于转基因成分的检测极其重要。本文从“功能核酸”与“生物传感器”的概念出发，重新认知、归纳、总结了基于分子扩增技术的转基因功能核酸生物传感器、基于不同信号输出方式的转基因成分功能核酸生物传感器和基于纳米材料的转基因成分功能核酸生物传感器。最后，对转基因成分检测的未来发展面临的挑战和趋势做出了展望。本文有助于推动转基因检测技术与功能核酸传感学科的发展。

　　关键词：　转基因检测; 功能核酸; 生物传感器;

　　Abstract：　The transgenic technology has been concerned greatly by people all over the world nowadays.Genetically modified organisms(GMOs),especially the GM crops have caused several controversial issues,including health problems, ecological environmental risks and even ethical concerns. From the perspective of'Functional Nucleic Acid' and 'Biosensors', this review summarized molecular amplification techniques,different ways of signal output and nanomaterials-based functional nucleic acid biosensors for detection of genetically modified ingredients. Finally, the challenges and trends in the future development of genetically modified components' detection are prospected. This review will be helpful for promoting the development of test techniques for GMOs and the progress of functional nucleic acid-based biosening disciplines.

　　Keyword：　Genetically modified organism detection; Functional nucleic acids; Biosensor;

　　近年来，转基因产业迅猛发展。目前，为方便政府对转基因作物进行监管，世界上已有50余个国家都对转基因食品实施标识管理制度。因此，标识制度与分析检测技术的关系十分密切：一方面分析检测水平为制度建立提供科学依据，另一方面标识制度的监管需要通过分析检测技术实现。早期的转基因分析检测技术主要包括：转基因成分筛查法、目的基因检测法和蛋白质检测法等。其中，成分筛查法只能检测出转基因产品中的通用元件，特异性不高，易出现假阳性结果；在外源DNA相同时，目的基因检测无法区分不同的转化事件；蛋白质检测则存在依赖于大型仪器、制备抗体等缺点。鉴于此，以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)为依托的功能核酸检测技术已经成为转基因成分检测的主流。

　　在传统认知中，核酸最重要的功能是遗传物质的载体；而随着对核酸高级构象与多样功能认知的深入，“功能核酸”的概念于2016年被系统地提出：将具有特殊结构与功能的核酸类物质都归纳入“功能核酸”的范畴(Xu,2016)。而生物传感器是指对生物物质敏感并将其浓度转换为可输出信号进行检测的装置，包括识别元件、信号放大元件与信号输出元件。鉴于PCR技术能够利用特异性的核酸引物识别基因组靶标区域、指数型核酸扩增的信号放大效果、利用电泳信号或荧光信号表征待测靶标的量，本文将以PCR技术为基础的检测方法归入“功能核酸生物传感器”的范畴，并从分子扩增技术、不同的信号输出方式与纳米材料等角度，对转基因成分的功能核酸生物传感器进行了综述。

　　1、 基于分子扩增技术的转基因成分功能核酸生物传感器

　　拟建立基于分子扩增技术的转基因成分功能核酸生物传感器，首先需要确认外源基因插入序列和与植物基因组的结合位点，即品系特异性测定的靶片段，重点在于确定插入的外源基因两侧的侧翼序列。目前，主流的侧翼序列鉴定技术主要包括：反向PCR技术(Zimmermann et al.,2000)，交错式热不对称PCR技术(Liu,Whittier,1995)，连接介导的PCR技术(Pfeifer et al.,1989)与A-T接头PCR技术(Trinh et al.,2012)。在确认了品系特异性测定的靶片段后，作者依据PCR技术对温度的需求，对转基因成分功能核酸生物传感器进行了归纳总结。
 

　　1.1、 基于变温分子扩增技术的功能核酸生物传感器

　　荧光探针/染料介导的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)生物传感器。该类方法是早期检测转基因成分的经典方法，其信号识别的原理在于荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET),RT-PCR生物传感器主要包括分子信标法、Taqman探针法、双杂交探针法、MGB(minor groove binder)探针法。其中，目前最常用的是Taqman探针法。除此之外，qRT-PCR生物传感器也可以利用荧光染料结合在产物DNA上的小沟的原理，释放定量荧光信号(Meistertzheim et al.,2012)。作为转基因成分检测的经典方法，该方法常被用于转基因成分的定量检测，例如转基因棉花(Gossypium spp.)Mon531(Yang et al.,2005)；转基因大豆(Glycine max)DP-356043-5(Wen et al.,2011)；转基因玉米(Zea mays)LY038(Nan et al.,2011)、Mon863(Yang et al.,2005)等。尤其是Mano等(2018)用qRT-PCR的方法检测转基因玉米，检测限低至0.005%，远远低于国家标准。

　　竞争子介导的竞争性定量PCR(quantification competitive(QC)-PCR)生物传感器。该类方法是依赖于竞争子的生物传感技术。其中，构建竞争子的关键要素包括：一是它要和靶基因的扩增效率相同，二是它在引物上的结合部位与靶基因在引物上的结合部位是一样的。在反应中，靶基因和竞争子竞争与引物结合，进行同步扩增。由于靶基因与竞争子之间的竞争，当靶基因含量降低，竞争子的扩增产物的量会逐渐增多，根据竞争子的含量制作标准曲线，就可以实现对靶基因的定量分析。Holck和Pedersen(2011)应用此方法检测了五种最新的转基因玉米：DAS59122、LY038、MON88017、MIR604和Event 3272，结果并未出现假阳性。

　　精准定量的数字PCR(digital(D)-PCR)生物传感器。D-PCR技术是依赖于单个靶分子的检测：当样本被稀释、分散形成大量液滴后，包含至少一个靶序列的液滴被定义为“阳性样品”。根据液滴的分隔方式，D-PCR分为两类：物理分隔法与液滴分隔法。其中，后者主要利用Bio-Rad QX100微滴式数字PCR系统生成，重复操作性更高(Hindson et al.,2011)。通过常规PCR热循环程序后，根据泊松分布对靶基因进行不依赖标准曲线的定量分析。Morisset等(2013)利用D-PCR检测转基因玉米MON810含量，获得了和定量PCR一致的结果。中国农业大学许文涛团队(Niu et al.,2018)以转基因玉米为样品，挑选四种转基因筛选元件和玉米内参基因为目的序列，开发了一种单荧光探针标记介导的单通用引物多重数字PCR(single universal primer-multiplex-ddPCR,SUP-M-ddPCR)转基因成分功能核酸生物传感器。该方法具有高通量，覆盖了超过93%的目前已批准的转基因品系，可以在短时间内对大量样品进行初步筛查，定量结果可以达到单拷贝数，能够实现对于转基因检测的“精确筛查”。

　　与RT-PCR生物传感平台、QC-PCR生物传感平台的相对定量分析相比，D-PCR生物传感器作为新兴平台，是一种不依赖标准曲线的绝对定量的传感分析方法，具有高灵敏度、高通量检测的潜力。但由于该平台依赖昂贵的传感设备，且使用不同的液滴分隔方法得出的转基因含量的总数存在可接受的差异，体现出较高的变异性，仍有待于开发与完善。

　　1.2、 基于恒温分子扩增技术的功能核酸生物传感器

　　基于环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的生物传感器。LAMP技术是利用嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)Bst DNA聚合酶与两对特异性引物扩增靶标序列的方法，主要通过可见沉淀法、荧光法、凝胶电泳法与仪器检测法对扩增产物进行终点定量(Luo et al.,2011;Li et al.,2014)，存在定量检测困难、污染性高的缺点。近年来，研究者将G-四链体脱氧核酶与LAMP技术结合，在内引物中插入G-四链体脱氧核酶的互补序列(信号前体)，待加入待测靶标启动LAMP反应后，扩增产生大量的富鸟嘌呤(guanine,G)序列；通过超声处理释放富G的功能核酸序列，加入氯化血红素形成G-四链体脱氧核酶、发挥类辣根过氧化物酶活性、催化过氧化氢与四甲基联苯胺显色，实现不依赖凝胶电泳或其他设备的裸眼可视化观察(Zhu et al.,2016)。

　　基于切刻内切酶介导恒温扩增(nicking enzyme mediated amplification,NEMA)的生物传感器。NEMA技术利用切刻内切酶，特异性地识别双链核酸的酶切位点、特异性切割一条链，实现高效扩增。NEMA技术的最新进展是SMB-NEMA技术。向NEMA过程中加入小分子信标，当它与靶片段杂交时能够发生构象上的变化，有效提高了检测灵敏度，能够对10 pg的靶标做出灵敏响应。其特点是小分子信标的解旋温度与反应温度相近，但却比传统的分子信标少大约十个碱基对。这种方法可以在传统NEMA的基础上进一步提高反应的灵敏度和特异性(Xu et al.,2016)。

　　基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的生物传感器。RPA技术可以模拟体内DNA复制的酶反应过程，在接近生物温度的37～39 ff区间，在20 min内实现对DNA模板的高效扩增。Santiago-Felipe等(2014)用此方法检测出了转基因番茄和玉米中的Camv35S启动子和NOS终止子。最新的进展中，贾玄等(2017)在RPA的基础上，结合DNA侧流纸基传感技术，实现了对转基因水稻PA110-15的特异性检测。

　　基于重组酶介导恒温扩增(recombinase-aid amplification,RAA)的生物传感器。RAA技术同样能够在恒温环境中快速扩增DNA，它和RPA技术的区别在于,RAA技术使用的重组酶是从细菌或真菌中提取的，而RPA技术使用重组酶是外源表达得到的。在恒定温度为37 ff的条件下，重组酶与引物结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上识别到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。RAA技术通常在1 h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。目前，使用RAA技术能够检测转基因水稻TT51-1中的NOS终止子和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt基因，建立了适用于野外检测的转基因快检程序(徐潮,2014)。

　　与基于变温分子扩增技术的功能核酸生物传感器相比，基于恒温分子扩增技术的功能核酸生物传感器不仅具备变温分子扩增技术扩增效率高、特异性强的优点，而且反应时间短、克服了热循环程序对反应设备的要求与限制，能够满足现场快速检测短时高效、设备便携的要求，更有利于转基因成分现场快速筛查的需求。

　　2、 基于不同信号输出方式的转基因成分功能核酸生物传感器

　　近年来，随着信号输出方式的迅速发展，突破了传统分子扩增技术单纯利用电泳信号输出与荧光信号输出的限制，促进了转基因成分功能核酸新型传感器的发展。本部分从表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)、电化学、测流纸基、压阻悬臂梁等角度归纳、总结新型的转基因成分功能核酸生物传感器。

　　2.1、 基于SPR的功能核酸生物传感器

　　SPR是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的金属介质界面时，金属中的自由电子发生共振的现象。将DNA探针修饰在等离子共振装置的表面，目标DNA的出现会导致等离子共振装置的折射率发生位移，以此表征转基因成分的存在。Mariotti等(2002)先将样品进行PCR扩增，进行信号放大；利用标记在等离子共振传感器表面的单链DNA探针，检测PCR扩增产物中的35S启动子和NOS终止子来检测转基因作物。Feriotto等(2002)将SPR传感器应用于抗草甘膦转基因大豆的基因测序：通过在等离子装置表面修饰不同的探针,实现了转基因产品的高通量检测。

　　2.2、 基于电化学的功能核酸生物传感器

　　使用电化学方法检测核酸分子杂交已经成为了继传统分子生物学方法后的另一有效的手段。例如，四氧化锇联吡啶(OsO4(bipy))可与DNA发生可逆的共价结合—OsO4(bipy)能够与嘧啶碱基反应，将嘧啶环中的碳碳双键氧化，从而形成锇酸的二元酸酯，产生高且可逆的伏安信号。根据该原理，Feriotto等(2002)制造出一种新型的方波伏安生物传感器，经不对称PCR后，单链DNA产物用[OsO4(bipy)]标记，能够与固定在金电极上的寡核苷酸探针进行分子杂交，通过监控伏安信号，检测转基因成分。将混有MON810转基因玉米的玉米面粉作为目标，使用该新型生物传感器进行检测。结果表明：所有的转基因玉米样品中都存在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的抗虫基因(Crylab)和MON810特异片段。

　　2.3、 基于侧流纸基的功能核酸生物传感器

　　为了满足转基因成分现场快速筛查的检测需求，具有便携、低成本的侧流纸基功能核酸生物传感器应运而生。中国农业大学许文涛团队(Cheng et al.,2017)利用复合标记环介导恒温扩增技术，搭载侧流纸基传感平台，建立了一种三叉戟式的测流纸基生物传感器，用于检测转基因复合性状：根据转化事件DP305423与GTS40-3-2，结合大豆卵磷脂的内标基因设计LAMP引物，区分扩增产物，能够高效、精准、高通量的检测三种扩增产物。

　　2.4、 基于压阻悬臂梁的功能核酸生物传感器

　　压阻悬臂梁是一种极其敏感的生物传感器，可以在纳米级别上检测靶分子的反应。其主要组成部分是一个水平的悬臂梁，其一端固定在支撑装置上，另一端可以自由移动。在检测DNA时需要引入纳米金粒子修饰过的单链探针，探针固定和分子杂交等相应生化反应都发生在悬臂梁表面。因为核酸的质量很小，杂交反应信息很难对压阻悬臂梁产生机械变形，所以要引入惰性重金属纳米金作为标记。根据Au-S强化学键，把探针固定在悬臂梁表面的金薄膜上，生物素修饰的靶基因与探针进行杂交，根据亲和素-生物素结合原理，链酶亲和素修饰的纳米金结合到杂交信息上，再利用连接DNA，增加纳米金的数量达到加重的目的。由于纳米金质量远远大于核酸质量，从而压重悬臂梁，使得悬臂梁弯曲，提高了检测的灵敏度。葛悦涛(2012)用这种传感器检测了转基因作物中常有的Bt基因。基于纳米金标记的压阻悬臂梁转基因生物传感器灵敏度高特异性强，有望未来实现对转基因成分的高通量检测。

　　2.5、 基于荧光信号的功能核酸生物传感器

　　与传统的分子扩增荧光生物传感器不同，单链核酸的高级构象往往具有特殊的光谱学特征。例如，硫酸氢黄连素能够与G-四链体功能核酸结合、促进该功能核酸元件形成稳定的椅子状高级构象，并发出强烈的荧光信号。基于此，Qiu等(2013)利用劈裂的G-四链体脱氧核酶元件，搭建了一种能够检测含花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)的35S(CaMV 35S)启动子的转基因产品的新型荧光生物传感器。南京大学鞠熀先团队(Zhu et al.,2018)利用DNA步行者(DNA walker)搭载锰离子依赖的切割型脱氧核酶，在二维平面的水平搭建出新型的内源微型小室，将图像处理技术与基于功能核酸的荧光传感技术结合，建立了用于检测转基因成分的荧光像素技术法辅助的新型生物传感器，这比传统荧光强度依赖型或者荧光点计数性传感器具有更好的灵敏度。

　　综上所述，新型的转基因成分功能核酸生物传感器往往具有特异性强、灵敏度高的优势，但仍然存在一定缺陷。例如，基于界面的SPR传感技术与电化学传感器往往受制于界面表面修饰的均一性，检测的可重复性仍有待提高。测流纸基传感器虽具有便携、低成本的优势，但在检测的灵敏度与假阳性结果等方面仍面临考验。基于荧光信号的生物传感器则需要开发配套的荧光检测装置实现其便携特性。

　　3、 基于纳米材料的转基因成分功能核酸生物传感器

　　随着纳米科技的发展，一系列纳米结构和纳米材料被广泛应用于生物传感器的搭建中。为了实现转基因成分的快速检测，一系列基于纳米材料的转基因成分的功能核酸生物传感器被建立。

　　3.1、 基于金纳米粒子的功能核酸生物传感器

　　Aghili等(2017)发明了一种新型电化学纳米生物传感器，利用石墨烯氧化物和金纳米粒子修饰制作丝网印刷碳电极，将特定的DNA探针以及苏木素作为电化学指示剂。为了检测CaMV 35S启动子，将特殊的烷基硫醇DNA探针固定在金纳米粒子表面，通过完善影响纳米生物传感器制造的因素(包括单链DNA植入过程、DNA分子杂交过程和苏木素本身的影响因素)，得出了最佳的电化学条件。该方法的检测限低，线性范围广，检测转基因成分快捷简单而且可靠。

　　3.2、 基于铂纳米粒子的功能核酸生物传感器

　　Wang等(2008)发明了一种新型功能核酸生物传感器，将铂纳米颗粒电沉积到玻碳电极表面。利用铂纳米颗粒超高的催化能力、吸附能力，以及促进电子转移的能力，铂纳米颗粒能够非常活跃地修饰电极表面的生物分子，用基本的电化学沉积手段就可以把铂纳米粒子直接沉积到玻碳电极表面。利用该电极检测CaMV 35S启动子，和裸露的玻碳电极相比，在比表面积相同时，沉积了铂纳米颗粒的玻碳电极的反应灵敏度有显着提高。

　　3.3、 基于碳材料的功能核酸生物传感器

　　Truong等(2010)发明了一种基于多壁碳纳米管-聚吡咯的功能核酸生物传感器。聚吡咯具有长期稳定导电且导电度高的优点。同时，功能化的聚吡咯由于其优良的电传导特性和表面功能，在无标记检测领域引起了高度关注。因此，将其与化学稳定性极高、导电性优良、机械强度大的多壁碳纳米管结合起来是非常巧妙的。研究中，CaMV 35S启动子序列是被检测的目标，电催化多壁碳纳米管-聚吡咯膜有很强的特异性，而且对于被检测物的浓度要求低，靶序列的最低浓度可为4×10-12mol/L。它不仅适合检测DNA，理论上也可用来制作蛋白质生物传感器。

　　3.4、 基于功能核酸纳米结构的生物传感器(G-四链体)

　　在功能核酸纳米结构的研究中，由富含鸟嘌呤的序列形成的G-四链体结构是一种非常重要的功能核酸，能够形成一、二、四股的螺旋结构，因此被广泛应用在比色生物传感器中。Jiang等(2014)设计出一种新型的无需标记的G-四链体脱氧核酶比色生物传感器。G-四链体与氯化血红素结合可形成脱氧核酶，能够催化2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS2-)转化为有色的自由基负离子ABTS-，利用底物颜色的变化能够对转基因成分进行定量分析。在实验中详细研究了各种相关的影响因素，例如探针的分裂模式，氯化血红素的浓度，氯化血红素与G-四链体的保温培养时间，还有探针与靶DNA的接触时间。在最佳的条件下，含有0.9%转基因成分的样品可以被检测出来，因此具有广阔的应用前景。

　　4、 总结与展望

　　本文从“功能核酸”与“生物传感器”的概念出发，重新认知、归纳、总结了基于分子扩增技术的转基因功能核酸生物传感器；并从SPR、电化学、测流纸基与压阻悬臂梁等角度，梳理了基于不同信号输出方式的转基因成分功能核酸生物传感器；最后，从纳米材料的视角，列举了典型的基于纳米材料的转基因成分功能核酸生物传感器。可以看出，转基因成分的检测正在向快速、便携、高通量、低成本、精准的方向发展，但仍然面临着体系复杂、可操作性欠佳、重复性差、灵敏度低、装置笨重的挑战。

　　因此，未来转基因成分功能核酸生物传感器的发展需要解决如下问题：1)实现界面修饰的标准化或建立可重复使用的界面，解决因界面修饰的不均一造成的SPR功能核酸生物传感器与电化学功能核酸生物传感器的重现性差的问题；2)实现纳米材料制备的标准化，解决因纳米材料差异造成的功能核酸生物传感器的重现性差的问题；3)开发新型纳米材料，并利用其纳米效应，简化功能核酸生物传感器的设计、提高其可操作性与检测性能；4)开发新型基于分子生物学的功能核酸生物传感技术，如CRISPR/CAS技术，迎接未来检测基因编辑等更高的检测需求，实现高通量、精准检测。

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