生物工程论文
摘 要
甲醛是一种极具代表性的室内有机污染物，对人体危害极大。甲醛治理措施包括物理措施、化学措施及生物措施。生物措施因安全有效，不会带来再次污染，对长期迟缓释放的甲醛有良好的治理效果等好处，在甲醛治理中存在明显优势。细菌是净化甲醛的主要微生物，对长期迟缓释放的甲醛有良好的治理效果，并且生物手段具有高经济效益、无污染、操作简便等优点，但从霉菌中检测到FADH活性的报道较少。本课题选用经诱变处理后的甲醛抗性菌株-宛氏拟青霉菌，对其进行液体培养，从而得到菌体，依次通过超声波细胞破碎、硫酸铵沉淀、透析及柱层析，纯化得到活性高的FADH。本实验的重点是通过DEAE-Sepharose、Sephadex-G100、CM-Sepharose三个柱层析条件的探索，提高酶活力，便于 后期制成 商品化 产 品投入市场 ，带 来良 好的 经济和 社会 效益。 结 果 表 明 ：
DEAE-Sepharose层析上样量为64 m L、洗脱流速为1.5 m L/min，Sephadex-G100凝胶过滤层析上样量为5%CV、洗脱流速为0.50 m L/min，CM-Sepharose上样量为3%CV、洗脱流速为0.75 m L/min时，对甲醛脱氢酶的分离纯化效果最佳。
关键词 ： 宛氏拟青霉菌 甲醛脱氢酶 蛋白质纯化仪 层析柱条件优化 酶活力测定。
Abstract
Formaldehyde is a representative indoor organic pollutant, which is harmful to human body.
At present, three methods are uesed for Formaldehyde treatment. They are the physical method,the chemical method and the biological method, respectively. Because of its safety and efficiency,biological method can not produce secondary pollution, and has good control effect onformaldehyde released slowly for a long time, so it has obvious advantages in formaldehydetreatment.Bacteria are the main microorganisms for the purification of formaldehyde, which hasgood control effect on formaldehyde released slowly for a long time, and has the adavantage ofhigh economic benefit, no pollution and simple operation. However, there are few reports on thedetection of FADH activity from mold.In this study, the formaldehyde-resistant strainPenicillium Wan, which was treated by mutagenesis, was cultured in liquid, and the bacteriawere purified by ultrasonic cell fragmentation, ammonium sulfate precipitation, dialysis andcolumn chromatography to obtain the highly active FADH.The key point of this experiment is toimprove the enzyme activity by exploring the three column chromatography conditions ofDEAE-sepharose Sephadex-G100 CM-sepharose, so as to make the commercial products intothe market in the later stage, and bring about good economic and social benefits. The resultsshowed that the amount of sample was 64 m L in the fraction DEAE-Sepharose chromatography,the flow rate of elution was 1.0 m L / min, the amount of sample in Sephadex-G100 gel filtration chromatography was 5%CV, the elution rate was 0.50 m L / min CM-Sepharose was 3%CV, andthe elution flow rate was 0.75 m L/min, the best separation and purification effect offormaldehyde dehydrogenase was obtained.
Key words : Paecilomyces variotii;formaldehyde dehydrogenase;Protein purifier;Chromatography purification condition optimization;Enzyme activity determination。
1、引言
1.1、甲醛简介。
1.1.1、甲醛的来源。
甲醛是一种极具代表性的室内有机污染物，长期存在于室内空间，是室内空气污染中主要污染物之一。室内甲醛的主要来源有两个方面，包括室内污染和室外污染。室外的甲醛污染气体在特定情况下可以进入室内，导致室内空气中含有较高的甲醛含量。室内甲醛则主要来源日化品和室内装修材料。其中，室内装修材料是目前室内甲醛污染的首要来源[1]。
1.1.2、甲醛的危害。
甲醛是一种原生物质，可经由吸入及皮肤接触对人体健康造成危害，它对人体的毒害涉及多系统、多器官。它对人的呼吸系统、免疫系统、肝脏、皮肤、内分泌系统都会产生危害。严重的还会产生胚胎毒性，引起胚胎畸形。甲醛还具有致癌作用，早在2004年国际癌症权威机构已将甲醛定义为第一类致癌物。另外，大量科学家研究发现甲醛污染可能与白血病的发生有关，但尚无证据证明两者间的因果关系[2]。不同浓度的甲醛对人体形成的危害具体表现为：当空气中甲醛的浓度达0.06mg/m3～0.07mg/m3时，儿童会发生气喘；达到0.1 mg/m3时，就有异味和不适感；达到0.5 mg/m3时，会刺激眼睛，导致流泪；达到0.6 mg/m3时可引起咽喉不适；浓度更高时，可引起恶心、呕吐、咳嗽、胸闷，甚至肺气肿；甲醛至30 mg/m3时，会马上致死[3]。
1.1.3、甲醛的治理方法。
目前处理甲醛有三种办法，即物理办法、化学办法和生物办法。物理办法效率较低，效果较差，不能从根本上解决甲醛污染。化学办法效率较高，不过成本也较高，并且可能产生二次污染，治理效果易受限制。生物办法安全有效，无二次污染，对长期迟缓释放的的甲醛治理效果优良，而且生物技术高经济效益、无污染、操作简单，能弥补物理和化学方法净化甲醛的缺点和弊端，因而受到广泛科研工作者和社会各界的关注，对净化空气和保护人类健康具有至关重要的意义[4]。生物方法主要有植物净化法和微生物降解法两种方法。植物净化法仅用于室内甲醛气体浓度很低的情况下，植物净化虽然作用时间久，但效果不够明显[5]。微生物因其独特的生物特性，在甲醛降解中具有广阔的前景。微生物类别多、代谢类型广且代谢效率高，可利用非碳碳键、低碳化合物等作为碳源兼能源，进而将有害物质转化为无毒或有益物质[6]。细菌是净化甲醛的主要微生物，对长期迟缓释放的甲醛有良好的治理效果，并且生物技术经济效益高、无污染、操作简略，但从霉菌中检测到FADH活性的报道较少[7]。
1.2、甲醛脱氢酶的作用机制。
NAD+和依赖型GSH对甲醛解毒的主要过程分为以下4步：⑴在特异性甲酸运载体的作用下甲醛从胞外运至胞内，再与GSH自发缩合形成S-羟甲基谷胱甘肽（HMGSH）；（2）HMGSH在FAD在的作用下氧化为S-甲酰谷胱甘肽，同时伴随着NAD+到NADH的转换；（3）S-甲酰谷胱甘肽在S-甲酰谷胱甘肽水解酶(FGH)的作用重新产生GSH并形成一分子甲酸；（4）甲酸在甲酸脱氢酶的作用下转化为二氧化碳，同时伴随着分子NADH的产生[8]。
1.3、甲醛脱氢酶的研究现状。
1.3.1、甲醛脱氢酶的结构。
甲醛脱氢酶是中等锌链醇脱氢酶家族中的一员，存在于绝大多数原核以及一切的真核生物中，对于微生物的甲醛解毒具有重要作用。分析发现的亚基分子量大小都在40KD左右，凝胶过滤层析显示出存在有二聚体和四聚体两种情况。大部分通常需要和谷胱甘肽参与甲醛的氧化。恶臭假单胞菌中的甲醛脱氧酶（是目前发现的唯一一个不需要参与即可以氧化甲醛的酶）[9]。
1.3.2、甲醛脱氢酶的制备与纯化。
细菌是净化甲醛的主要微生物，降解甲醛的真菌报道相对较少。甲醛脱氢酶在细菌[10]和酵母菌[11]中均有发现。目前，净化甲醛的细菌主要有恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、甲基营养菌等。假单胞菌属和甲基营养菌是净化甲醛的主要细菌[12]。这些菌种都可以通过分离纯化得到相应的甲醛脱氢酶。但是来源不同的甲醛脱氢酶降解甲醛的效果也各不相同，因此尽量筛选不同的甲醛降解菌，并对其进行分离纯化，将得到的高纯度酶液用于实际的甲醛治理，通过比较不同菌种筛选的难易、保藏条件及纯化条件，提纯出的甲醛脱氢酶的酶学性质及固定化的难易和甲醛治理的效果，以便找到最适合的甲醛降解菌。从目前的报道来看，来源于曲霉属的FADH研究较多[13]，但来源于其他属的霉菌鲜有报道，故本实验利用具有甲醛抗性的宛氏拟青霉菌作为提取甲醛脱氢酶的对象，并通过一系列的生化实验手段进行纯化，主要通过三步柱层析条件的优化，寻找最佳纯化条件，获得高纯度的甲醛脱氢酶液。由于目前对甲醛脱氢酶的研究尚不成熟，因此将甲醛脱氢酶投入市场并应用于实际生活仍需较长时间。
1.4、实验目的与内容。
本课题选择宛青拟霉菌为试验菌株，通过液体培养及一系列的生化分离手段，将其产生的甲醛脱氢酶纯化分离。本实验主要通过柱层析条件的探索，并以酶活为指标，提高酶活力。主要从柱子的上样量及流速等方面来研究甲醛脱氢酶的最佳纯化条件。
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2、材料与方法
2.1、实验材料
2.1.1、 菌种
2.1.2、培养基
2.2、主要试剂与溶液配制.
2.2.1、主要试剂
2.2.2 、溶液贮存
2.3 、主要仪器与设备
2.4、实验方法
2.4.1、F1-23 的活化
2.4.2、F1-23 的液体培养
2.4.3、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
2.4.4、FADH的粗提取
2.4.5、FADH酶活的测定方法
2.4.6、硫酸铵沉淀
2.4.7、透析
2.4.8、DEAE-Sepharose层析条件的探索
2.4.9、Sephadex-G100凝胶过滤层析条件的探索
2.4.10、CM-Sepharose层析条件的探索
2.4.11、SDS-PAGE电泳
3、结果与分析
3.1、蛋白质标准曲线的绘制
3.2、DE AE - SepharoseAKTA层析图谱
3.3、Sephadex-G100洗脱曲线
3.4、CM-Sepharose洗脱曲线
3.5、SDS-PAGE电泳
3.6、SFADH的纯化效果.
4、结论与展望
随着生活水平和科学技术的发展，人们越来越关注自身的健康问题，对室内甲醛含量的关注也日益增加。室内甲醛对人类的健康威胁较大，而且很难避免。因此，甲醛降解方面的研究是一个热门课题，具有巨大的发展潜力，也会带来巨大的经济效益和社会效益。
实验的最终结果是通过一系列的生化分离得到了纯度较高的甲醛脱氢酶酶液。当DEAE-Sepharose层析上样量为64 m L、洗脱流速为1.5 m L/min，Sephadex-G100凝胶过滤层析上样量为 5%CV、洗脱流速为0.50 m L/min，CM-Sepharose上样量为3%CV、洗脱流速为0.75 m L/min时，对甲醛脱氢酶的分离纯化效果最佳。但是实验主要是通过对三步柱层析条件进行优化来纯化甲醛脱氢酶，操作相对复杂、耗时久而且纯化的花费较高，故在实际生产中有一定的局限性。因此，可以考虑直接采用三级色谱柱连用，或者利用亲和层析纯化。也可以先测出甲醛脱氢酶的等电点，直接采用两步柱层析纯化酶液。
甲醛脱氢酶的特异性和灵敏性很高，便于检测和治理甲醛。但是甲醛脱氢酶对环境要求高，温度、湿度、酸碱度都会影响它的活性；其次这类物质的稳定性差，易分解，所以无法保证长期的除甲醛效果；最后这类方法的安全性尚待验证，因为该类技术仍处在研究阶段。本实验尚未对甲醛脱氢酶进行固定，故还无法直接应用于家庭，也不能直接降解空气中的甲醛。甲醛脱氢酶的固定化方法的研究是至关重要的，如果该方面取得较大进展，对于家庭的甲醛治理将会十分有益。
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