包覆相脂解酶活性与制备

　　1 脂解酶简介

　　1.1 脂解酶根据其催化特性分类
　　
　　1.1.1 非特异性脂解酶（non-specificlipase）。此类脂解酶并不对三酸甘油酯的酯键有选择性，即脂解酶对三个酯键均可以进行反应（如水解、转酯化反应）。

　　1.1.2 1,3特异性脂解酶（1,3-specificlipase）。此类脂解酶只会对三酸甘油酯上之第1、3位之酯键进行反应，第2位之酯键则否。以水解三酸甘油酯为例：当1,3特定位脂解酶将三酸甘油酯水解成1,2或（2,3）-diglycerides,此时第2位酯键会自发性进行酰基转移（acyl migration）至第1或（3）位，进而再被1,3特异性脂解酶水解。

　　1.1.3 特定脂肪酸脂解酶（fatty acid specificlipase）。如Geotricbum candidium生产之脂解酶只对特定结构之脂肪酸有活性。此脂解酶只对三酸甘油酯中，第九个碳上有顺式双键的不饱和脂肪酸进行反应。对于饱和脂肪酸（无双键）、第九个碳上为单键则无反应。

　　1.2 生理及物理之特性
　　
　　1.2.1 微生物脂解酶通常比植物或动物脂解酶更具稳定性。

　　1.2.2 嗜热微生物脂解酶在高温与不利的化学环境下较为稳定，极具工业应用之潜力。

　　1.2.3 由于酵素的专一性，不必要的副产物可以减少。

　　脂解酶是水解酵素的成员之一，作用于羧酸酯键。

　　其生理角色是水解三酸甘油酯产生双酸甘油酯、单酸甘油酯、脂肪酸、甘油。除了可水解羧酸酯键，脂解酶亦可在非水相环境下催化酯化反应、内酯化反应、转酯化反应。因此，多元化的催化能力使得脂解酶可以应用于食品、清洁剂、制药、皮革、纺织、化妆品、造纸工业等（Hasan et al.,2006）。

　　2 Pseudomonas cepacia脂解酶介绍

　　在醇解反应中探讨不同微生物来源之脂解酶，其中Pseudomonas cepacia脂解酶催化醇解反应并加入油重1~20wt%之水分，反应90h后脂肪酸甲酯含量超过80%.当水含量低时，Candida rugosa及P.fluorescens脂解酶其反应速度显着下降，显示水可避免甲醇使这些酵素失活。另外，P.cepacia脂解酶于醇解反应中醇油莫耳比高达2∶1或3∶1时，仍能达到高甲基酯含量，故P.cepacia脂解酶较其他微生物来源之脂解酶对醇类耐受性较高。

　　以X-ray结晶法分析P.cepacia脂解酶在无抑制剂下之结晶结构，结构显示脂解酶含有α/β水解酶折迭以及三个具催化活性之残基Ser87、His286、Asp264.此酵素与同源之P.glumae脂解酶及Chromobacterium viscosum脂解酶在结构上有数个共通点，其中包含Ca2+结合位。此脂解酶呈现openconformation,其中包含溶剂可接触之活性位；相较于P.glumae脂解酶，其活性位隐藏于关上之“lid”之下。P.cepacia脂解酶之open conformation显示此酵素可在油水接口活化，活化时应伴随二级结构之调整使“lid”开启，将活化位暴露于外。

　　3 包覆相脂解酶活性分析

　　（1）包覆相脂解酶活性测量方法是将810μL的50mMTris HCl buffer,pH8.0（含有0.4% TritonX-100及0.1%arabic gum）、90μL pNPL与100μL包覆相脂解酶溶液混合；（2）将此反应置于hybridization oven中反应温度37℃，50rpm,反应10min;（3）离心5min后抽取上清液，以去离子水稀释10倍后在A410下测量其吸收，再利用pNP标准曲线计算活性。

　　4 制备包覆相脂解酶

　　（1）取228μL tetramethoxysilane（TMOS）并加入1272μL 1mM HCl,于室温下反应15min使其水解，最终浓度为1M.由于水解后之TMOS长时间储存会凝结成胶，故每次包覆前均需准备全新之TMOS水解溶液；（2）包覆之反应溶液中包含7.5mL 0.1M KH2PO4（pH7.8,含有0.1NNaOH）、1.5mL 1M TMOS、1.5mL500mg/mL脂解酶与1.5mL去离子水，最后加入3mL 5mMPAA以起始反应；（3）于室温下反应5min后，以离心（×100g,2min）进行固液分离并抽出上清液，接着使用15mL去离子水清洗包覆相脂解酶两次，悬浮于去离子水中，最后将其冷冻干燥备用；（4）包覆效率系以下列公式计算：【1】

    残余脂解酶量系指上清液及清洗液中脂解酶之含量，测定其脂解酶之活性，并由脂解酶浓度-活性标准曲线计算；（5）活性回收系以下列公式计算：【2】

　　5 包覆相脂解酶之特性

　　本研究中包覆效率（包覆相酵素质量/添加酵素质量）为93%±9%.未包覆脂解酶其比活性为24±11U/mg,包覆相脂解酶之比活性为15±8U/mg;平均活性回收（包覆相脂解酶比活性/液相脂解酶比活性）为58±5%,以上实验次数均为5次。先前研究中以TMOS将P.cepacia脂解酶包覆；其包覆率为96%,活性回收为51%,与本研究实验结果相近。而McAuliffe等人（2005）以polyethyleneimine（PEI）催化仿生氧化硅形成，用以包覆脂解酶，其活性回收低于10%;明显较本研究为低。

　　经钼硅酸盐比色法之结果显示，以PAA为形成氧化硅之模板，其氧化硅产量为每100μl反应体积产生0.73±0.09mg（N=3），可换算出酵素承载量为6.7±0.8g脂解酶/g SiO2（N=3）。Pencreac'h与Baratti指出Amano公司之商业化脂解酶，经过Lowry法之检测，脂解酶粉末所含之蛋白质约只占其质量6%（60mg/g powder,6%），水分约占2.3%.相较于Chen等人之研究结果，其氧化硅产量为每100μL反应体积产生0.24mg;其原因可能为本研究采用PAA之浓度为5倍（5mM vs.1mM），先前研究指出氧化硅生成量与催化剂使用浓度有关。

　　6 转酯化条件

　　无论有无包含脂解酶或经冷冻干燥处理，其形态并无明显之差异，均为颗粒与颗粒彼此相互融合或团聚而形成之结构。为准确控制含水量，采经冷冻干燥后之包覆相脂解酶进行生质柴油转化。

　　进行转酯化反应时，许多条件均会影响转酯化之结果，如反应温度、反应时间、醇油莫耳比、甲醇批次添加与否、含水量、酵素添加量等。以上诸多因子中选取有影响性之因子，再以反应曲面法探讨因子间之交互关系并找出最适化之反应条件。

　　制备生质柴油最常以蔬菜油为原料，但其成本过于高昂又有与民争食之疑虑，因此，选择成本较低廉之废食用油是为经济又环保的做法。

　　大豆油与废食用油之酸价分别为0.3±0.1、1.4±0.1mg KOH/g（N=3），显示废食用油于使用过程中可能发生氧化及水解，使酸价较大豆油高约5倍。而本研究所使用之大豆油及废食用油之皂化价分为175及195mg KOH/g,两者无明显差距。

　　7 结语

　　温度是决定酵素反应速率的因素之一，在一定的温度范围内酵素活性随温度升高而增加。高于此温度范围后，酵素之构型改变造成不可逆之活性丧失；低温时，酵素作用减缓，然其活性可藉由升温再度回复。

　　Noureddini等人研究固定化P.cepacia脂解酶之最适温度，发现于35℃时有最佳之转酯化活性。以反应曲面法探讨生质柴油之反应温度（40℃、50℃、60℃），结果最佳温度为52.1℃。