生物工程论文
近年来，许多工业化学物质被释放到环境中，其中一些化学物质具有类似体内激素的作用，影响和干扰了生物体内分泌统的正常功能，导致人和动物的生殖系统发育不良，生育能力下降，并引起各种生理异常，这类物质通常称为“环境激素”[1].双酚A（bisphenol A,BPA）学名为2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，属于一种酚类雌激素。BPA是一种重要的化工原料，主要用于生产聚碳酸酯和环氧树脂等高分子材料[2-3].聚碳酸酯广泛用于水瓶、婴儿奶瓶、罐头瓶等食品和饮料容器。环氧树脂常用作一些金属食品容器的内壁涂层，防止食品腐蚀金属容器内壁[4].这些食品包装材料中微量的BPA可以迁移到食品和周围环境中，通过食物链或生物链进入生物体内，对人和动物的健康造成威胁[5].近几年研究表明，BPA可以影响生精细胞周期，干扰精子的正常产生，影响生殖功能。BPA也可以诱导淋巴细胞的增殖，具有潜在的免疫毒性。BPA还能诱发乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜异位等疾病[6-7].因此，加强BPA的残留检测，对保护人类健康和生存环境具有重要意义。目前，国内外关于BPA残留的检测方法主要有：紫外分光光度法[8]、电化学法[9-10]、高效液相色谱-紫外法[11]、高效液相色谱-荧光法[12-14]、气相色谱法-质谱法[15-16]等。
高效液相色谱-荧光法检测食品中BPA残留的检测限可达到0.1~2 ng/mL.这些传统的仪器分析方法具有检测结果准确、稳定、可靠等优点，但其需要昂贵的仪器、复杂的操作和复杂的样品前处理，不适用于大量样品的快速检测。而酶联免疫分析（enzyme linked immunosorbentassay,ELISA）法[17-19]具有简便、快速、灵敏、特异性好等优点，这对BPA的残留检测具有重要的意义。
本实验成功地合成了BPA人工抗原，制备了BPA的单克隆抗体，并初步建立了间接竞争ELISA法，检测BPA的残留。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
BPA标准品、卵清蛋白（ovalbumin,OVA）和羊抗小鼠酶标二抗 美国Sigma公司；N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide,NHS） 美国Aladdin公司；双酚酸（valeric acid,BVA） 日本Tokyo Kasei公司；四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine,TMB）、1 - 乙基 - 3 - （ 3 - 二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl） carbodiimidehydrochloride,EDAC） 中国生工生物公司；抗BPA单克隆抗体3H1由本实验室自制。
包被缓冲液：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline,PBS,pH 7.4）；封闭液：取5 g脱脂奶粉溶于100 mL 50 ℃的蒸馏水；洗涤液：PBST缓冲液即含0.05%吐温-20的PBS;标准品稀释液：超纯水。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
U V - 2 6 0 0 紫外分光光度计 上海尤尼柯公司；Multiskan MK3酶标仪、WELLWASH VERSA洗板机美国Thermo公司；Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司；Centrifuge 5804R型离心机 德国Eppendorf公司；酶标板 美国Costar公司。
1.3 方法
1.3.1 BPA人工抗原的合成
参照文献[20]加以改进，以BVA作为BPA的半抗原引入羧基，称取BVA 0.45 mg,NHS 1.49 mg和E D A C 2 . 2 8 m g 溶于 1 5 0 μ L 二甲基甲酰胺， 1 7 ℃，130 r/min避光反应16 h.反应后所得溶液为A液。称取5.8 mg OVA 溶于2 mL 0.13 mol/L NaHCO3溶液中，得到OVA溶液。将A液逐滴加入OVA溶液中，边加边搅拌，17 ℃，130 r/min避光反应12 h.然后将反应后的混合液转入透析袋中，在4 ℃，0.01 mol/L pH 7.4的PBS中透析2 d,期间换液2 次，以去除未反应的BVA等小分子物质。透析后的偶联物进行紫外扫描。免疫抗原BVA-血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）以相同的方法制备。
1.3.2 BPA单克隆抗体的制备与纯化
第3次免疫后21 d对免疫效价较好的小鼠尾静脉注射人工抗原加强免疫，3 d后，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇作用下进行细胞融合。在HAT完全培养基中培养7 d,换HT完全培养基，观察杂交瘤细胞生长情况，取培养上清液，用间接竞争ELISA方法筛选分泌抗BPA单克隆抗体的杂交瘤细胞。阳性细胞经有限稀释法亚克隆3 次的抗体阳性率均为100%后，建立细胞株并用液氮冻存。取8~10 周龄BALB/c小鼠注射液体石蜡，0.6 mL/只，一周后每只注入1 mL BPA杂交瘤细胞3H1,7~10 d后采集腹水用辛酸-硫酸铵法[21]纯化，纯化后的抗体用紫外扫描测定其蛋白含量。最后用单克隆抗体分型试剂盒进行亚型鉴定。
1.3.3 间接竞争ELISA法的建立
1.3.3.1 检测抗原包被质量浓度和抗体最佳稀释比例的确定用PBS将BVA-OVA分别稀释至0.5、1、2、4、6 μg/mL,4 ℃包被过夜，PBST洗板4 次，每孔加入320 μL 5 mg/mL脱脂奶37 ℃温育2 h.洗板机洗板4 次，加入PBS稀释的抗BPA单克隆抗体3H1,按照1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000的比例倍比稀释，进行方阵滴定确定抗原的包被质量浓度和抗体的最佳稀释比例。
1.3.3.2 有机溶剂对抗原抗体结合的影响用pH 7.4的 0.01 mol/L的PBS缓冲液稀释包被抗原至最佳质量浓度包被到酶标板上，分别用含不同体积分数甲醇溶液稀释BPA标准品至系列质量浓度，然后按间接竞争ELISA法进行测定，比较最大光密度值和IC50值，考察有机溶剂对抗原抗体结合的影响，确立标准品最佳的稀释缓冲液。
1.3.3.3 抗体稀释缓冲液pH值的优化用不同pH值（6.4、7.4、8.4、9.4）的PBS稀释的抗体和最佳稀释缓冲液稀释的BPA标准品，按照间接竞争ELISA法反应，比较最大光密度值和IC50值的变化。
1.3.3.4 ELISA标准工作曲线的建立根据确定的抗原最佳包被质量浓度和抗体的最佳稀释比例，建立BPA间接竞争ELISA的标准曲线。用PBS将BVA-OVA稀释至最佳质量浓度包被酶标板，120 μL/孔，4 ℃包被过夜，用5 mg/mL的脱脂牛奶封闭。PBST洗板4 次，加入系列超纯水稀释的BPA（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、200 ng/mL）和最佳稀释比例的抗体各50 μL,混匀，37 ℃温育40 min;洗板4 次后每孔加1∶2 500的酶标二抗100 μL,37 ℃温育40 min;洗板4 次，每孔加100 μL TMB显色液37 ℃显色8 min;取出每孔加50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定OD450 nm值。按式（1）计算各质量浓度的结合率，并绘制标准曲线。【1】
1.3.3.6 加标回收率的测定以某品牌塑料瓶装的矿泉水为样品。用矿泉水配制质量浓度为100 ng/mL的BPA加标溶液。分别吸取BPA加标溶液（100 ng/mL）1.25、2.5、12.5、50 mL于50 mL容量瓶中定容，混合摇匀，得到一系列不同质量浓度的BPA加标溶液，以矿泉水为对照样品，分别按照间接ELISA法进行测定，每个质量浓度平行测定5 次，计算加标回收率。
2 结果与分析
2.1 BPA人工抗原的紫外扫描结果
采用活泼酯法将BVA与OVA偶联，合成了人工抗原BVA-OVA.紫外分光光度计对BVA、OVA和BVA-OVA进行扫描，结果见图1.对比3 条曲线可以看出，同质量浓度的OVA和BVA-OVA偶联物在280 nm左右均有特征吸收峰，而偶联物在280 nm的峰高相对较高，且发生了一定的位移。这说明BVA和OVA的特征吸收峰发生了叠加，因此可以判断BVA与载体蛋白OVA偶联成功。同理，由图2可以判断BVA与载体蛋白KLH偶联成功。【2】
2.2 BPA单克隆抗体的制备
经细胞融合，筛选得到一株分泌抗BPA单克隆抗体的细胞株，命名为3H1.分泌的单克隆抗体经测定属于IgG1亚型，轻链为κ链。注射杂交瘤细胞的小鼠，7 d左右小鼠腹部明显膨胀，行动迟缓。观察小鼠状况，采集腹水，辛酸-硫酸铵法纯化腹水。腹水纯化后，采用紫外分光光度计法计算抗体蛋白含量。根据公式[22]C/（mg/mL）=（1.45A280 nm-0.74A260 nm）×稀释倍数，计算得到抗体蛋白质量浓度为7.56 mg/mL.
2.3 包被抗原质量浓度和抗体最佳稀释比例的确定
采用方阵滴定法进行间接ELISA测定，选择光密度值为1.0左右时包被抗原的质量浓度和抗体稀释比作为最佳条件。在抗体稀释度为1∶512 000时，包被抗原质量浓度达到1 μg/mL后，对应的光密度值随抗原质量浓度的增大变化不明显，且光密度值达到1.0,因此选择1 μg/mL为抗原的包被质量浓度。