药学论文
摘 要： 目的 ：探讨胺碘酮对大鼠睾丸质量、形态、酶活性及精子活力的影响。方法 ：健康雄性SD大鼠随机分为对照组、低剂量组和高剂量组，连续灌胃方式给予胺碘酮4周。处死大鼠后，分离大鼠双侧睾丸，并称重；光学显微镜观察精子活力，H-E染色观察睾丸形态；采用乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、一氧化氮合酶（NOS）及一氧化氮（NO）检测试剂盒分别测定LDH、SDH和NOS活性及NO含量。结果 ：高剂量组大鼠出现精神萎靡、毛发灰暗、活动减少现象，攻击性行为增强。高剂量组大鼠睾丸部分曲细精管外壁出现褶皱，生精上皮细胞排列不规则。睾丸质量、睾丸组织LDH活性和SDH活性方面，低剂量组、高剂量组与对照组差异无统计学意义；睾丸组织NOS活性、NO含量和精子活力方面，低剂量组与对照组差异无统计学意义，但高剂量组与对照组差异有统计学意义。结论 ：高剂量胺碘酮导致成年雄性大鼠睾丸形态改变，睾丸NOS活性增高，NO含量增加，精子活力下降，表明高剂量胺碘酮可能对雄性睾丸有一定影响，从而影响雄性生殖功能。
关键词： 胺碘酮; 睾丸; 酶活性; 大鼠;
Abstract： Objective :To investigate the effects of amiodarone on testicular weight, testicular morphology, testicular enzyme activity and sperm motility in rats. Methods :SD rats were randomly allocated into control group, low-dose group and high-dose group and continuously gavaged with amiodarone for 4 weeks. When the rats were sacrificed, the testes of the rats were quickly separated and weighed;testicular morphology and sperm mobility were observed by light microscopy; lactate dehydrogenase(LDH), succinate dehydrogenase(SDH) and nitric oxide synthase(NOS) activities and nitric oxide(NO) levels were determined by LDH, SDH, NOS and NO assay kits, respectively. Results :The rats in the high-dose group showed listlessness, gray hair, decreased activity and increased aggressive behavior. Part of ektexine of the seminiferous tubule of the testes of the rats in the high dose group was folded, and the spermatogenic epithelial cells were irregularly arranged. In terms of testicular quality, testicular LDH activity and SDH activity, there were no statistically significant differences between the low-dose group and the high-dose group and the control group. In terms of NOS activity, NO content and sperm motility in testicular tissue, there were no statistically significant differences between the low-dose group and the control group, but there were statistically significant differences between the high-dose group and the control group. Conclusion :High-dose amiodarone causes irregular arrangement of seminiferous tubules in the testis, increase of NOS activity and NO content in the testis, decline of sperm motility, which indicates that high-dose amiodarone may have an impact on male testis and affect male reproductive function.
Keyword： amiodarone; testis; enzyme activity; rat;
胺碘酮作为一种广谱抗心律失常药，属Ⅲ类抗心律失常药物，是当前最常用的抗心律失常药物之一[1]。胺碘酮具有转复房颤，改善窦性心律的作用，可通过延长旁道的不应期治疗预激综合征伴房颤，治疗效果安全有效。胺碘酮对心肌具有保护效应，通过降低血压及窦房自律性来减轻心肌耗氧量及外周阻力，使心力衰竭患者心功能改善。但胺碘酮对男性生殖系统有损害，Gasparich等[2]临床观察发现胺碘酮可导致附睾炎及性功能障碍。Nikolaou等[3]报道随胺碘酮剂量增加，其可在附睾积累。国内外虽已经就胺碘酮对大鼠睾丸的影响进行了一定的研究，但胺碘酮对睾丸组织的具体影响及其机制的研究鲜有报道。因此，本研究通过对雄性大鼠灌胃给予胺碘酮连续用药，研究胺碘酮对大鼠睾丸质量、形态、酶活性的影响，探讨胺碘酮对睾丸及男性生殖功能的影响。
1、 材料和方法
1.1 、动物及分组
30只8周龄健康成年雄性SD大鼠购自贵州医科大学实验动物中心，体质量220～260 g。大鼠随机分为对照组（0 mg·kg-1·d-1）、低剂量组（20mg·kg-1·d-1）和高剂量组（200 mg·kg-1·d-1），每组10只。采取灌胃方式给予葡萄糖胺碘酮溶液，灌胃量为1.0 m L/kg（每周测量体质量），每天分2次给药，连续给药4周。每日观察动物的精神、饮食、毛色及活动等一般情况。
1.2 、测定大鼠睾丸质量
在对大鼠末次给药24 h后，使用10%水合氯醛麻醉后脱颈法处死大鼠。快速解剖取出双侧睾丸及附睾，分离周围脂肪组织，漂洗，将睾丸进行称重。
1.3、 精液样本制备及精子活力测定
取出右侧附睾组织为标本，用眼科剪刀剪开，将精液加入生理盐水1 m L稀释，制作成精子悬液，把稀释后的精子悬液制作精子涂片，低倍镜下选择合适视野，要求保持精子清晰可见、无明显重叠区域；然后在高倍镜（400倍）下观察精子活力。
1.4、 睾丸组织病理学观察
睾丸组织经4%甲醛液给予固定12 h后，转至30%蔗糖溶液脱水24 h，经用OCT包埋剂包埋样本，冰冻切片，苏木精-伊红（H-E）染色法进行染色，再应用光学显微镜观察大鼠睾丸组织形态改变，且拍照保存。
1.5 、睾丸组织匀浆制备
称量大鼠睾丸组织质量后再将睾丸组织剪碎，按照质量比例为1∶9加入生理盐水，制备成10%的睾丸组织匀浆，取匀浆上清液待行酶活性检测。
1.6 、睾丸组织乳酸脱氢酶（LDH）活性、琥珀酸脱氢酶（SDH）活性、一氧化氮合酶（NOS）活性和一氧化氮（NO）含量的测定
分别按照LDH试剂盒、SDH试剂盒、NOS试剂盒和NO试剂盒检测。
1.7 、统计学处理
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。数据以表示。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One-Way ANOVA）。采用SNK检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 、结果
2.1、 胺碘酮对大鼠一般情况的影响
对照组大鼠被毛光泽，饮食、活动正常。给药后，高剂量组大鼠出现精神萎靡、毛发灰暗、活动减少现象，但攻击性行为增强。
2.2、 胺碘酮对大鼠睾丸质量的影响
对照组、低剂量组、高剂量组睾丸质量分别为（3.42±0.25)g、（3.35±0.32)g、（3.22±0.28)g，低剂量组、高剂量组与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.3、 胺碘酮对大鼠精子活力的影响
对照组、低剂量组、高剂量组精子活动分别为（58.12±12.58）%、（51.36±11.25）%、（42.64±13.20）%，低剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4、 胺碘酮对大鼠睾丸组织形态的影响
对照组大鼠睾丸曲细精管结构完整，生精上皮完整，层次较清晰（图1A）；低剂量组大鼠睾丸曲细精管结构完整，生精上皮细胞排列较规则（图1B）；高剂量组大鼠睾丸部分曲细精管外壁出现褶皱，生精上皮细胞排列不规则（图1C）。
2.5、 胺碘酮对大鼠睾丸组织LDH活性的影响
对照组、低剂量组、高剂量组睾丸组织LDH活性分别为（1 023.34±102.41）、（992.18±98.56）、（978.45±106.25) U/gport，低剂量组、高剂量组与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.6、 胺碘酮对大鼠睾丸组织SDH活性的影响
对照组、低剂量组、高剂量组睾丸组织SDH活性分别为（15.72±2.21）、（14.86±1.74）、（14.21+1.96) U/mgprot，低剂量组、高剂量组与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.7 、胺碘酮对大鼠睾丸组织NOS活性的影响
对照组、低剂量组、高剂量组睾丸组织NOS活性分别为（2.92±0.28）、（3.11±0.27）、（3.40±0.46)U/mgprot，低剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
图1 大鼠睾丸组织形态观察，H-E染色，×400
A：对照组；B：低剂量组；C：高剂量组
2.8、 胺碘酮对大鼠睾丸组织NO含量的影响
对照组、低剂量组、高剂量组睾丸组织NO含量分别为（2.72±0.21）、（2.84±0.16）、（3.02±0.30）μmol/gprot，低剂量组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 、讨论
3.1 、胺碘酮对大鼠一般情况、睾丸质量及形态的影响
本研究表明高剂量胺碘酮对成年雄性大鼠的一般状况可产生消极影响，主要表现为高剂量组大鼠普遍精神状态欠佳、活动减少，原因可能是胺碘酮对神经系统、消化系统[4]的副作用所致。范甜甜等[5]对小鼠施加农达（200 mg/kg）药物后，显示睾丸及附睾质量均明显下降，农达对睾丸有损伤效应；据报道高脂饮食会使睾丸质量下降，是由于高脂饮食诱导睾丸细胞凋亡[6]。本研究表明胺碘酮对睾丸质量没有明显影响，考虑可能是胺碘酮实验作用时间较短的原因；高剂量组大鼠睾丸部分曲细精管外壁出现褶皱，生精上皮细胞排列不规则，其具体机制国内外未见报道，本课题将进一步研究。
3.2、 胺碘酮对LDH、SDH的影响
睾丸组织内存在有多种酶，其中LDH、SDH是参与睾丸代谢的重要酶。LDH主要参与糖酵解和糖异生过程中催化乳酸和丙酮酸之间氧化还原反应[7]，通过催化丙酮酸接受酰胺嘌呤二核苷酸中的氢转化为乳酸，产生氧化状态的辅酶Ⅰ（NAD），形成酸性内环境和提升糖酵解速率，从而维持糖酵解ATP的持续生成，使细胞进行糖酵解[8]。据报道睾丸损伤后，LDH活性显着降低[9]。本研究表明胺碘酮对睾丸内LDH没有产生明显影响，具体机制还需进一步研究。SDH属于细胞色素氧化酶，是三羧酸循环中唯一一个整合于线粒体内膜上的多亚基酶，为连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一[10]。在睾丸中，SDH主要分布在睾丸曲细精管生精细胞的线粒体内，可把果糖转化为山梨醇，再转化为葡萄糖，供应能量消耗，对睾丸成熟、精子能量代谢、功能成熟和形态完善起重要作用。据报道SDH活力降低可造成精子成熟障碍[11]。本研究表明胺碘酮对睾丸内SDH没有产生明显影响，具体机制还需进一步研究。
3.3、 胺碘酮对NOS、NO及精子活力的影响
NOS广泛分布于动物睾丸、附睾、输精管和前列腺中[12]。睾丸NOS活性是判断药物对雄性大鼠睾丸生殖毒性的较敏感指标。NOS参与睾丸微动脉血流调节、精子发生过程及睾酮分泌，并且在精子的退化和凋亡中也具有重要作用[13]。NO是一种动物细胞内重要信使分子，参与细胞内重要的生理和病理活动。NO是一种重要的炎症递质，在病理状态下，通过脂多糖、干扰素等炎症趋化因子，与线粒体内氧自由基等反应生成活性氮氧化合物，作用于蛋白质、脂质及DNA等大分子物质，抑制呼吸链传导，抑制ATP的合成，抑制DNA合成，造成细胞DNA损伤，从而引起细胞凋亡[14]。NO可直接或间接损伤雄性生殖系统，使精子运动能力及速率减慢，影响精子发生和获能过程[15]。本研究表明高剂量胺碘酮引起睾丸细胞NOS活性增高，进一步使睾丸组织生成NO的能力增强。增加的NO结构上具有活性很强的自由基，增强了细胞膜脂质的过氧化反应，生成细胞毒性更大的过氧亚硝酸根，诱发睾丸细胞坏死和凋亡[16]。本研究结果表明高剂量胺碘酮导致精子活力降低，其可能的原因是睾丸组织NO作用于正常生理状态和内环境稳态，使血管扩张，血流量增加[17]，微循环得到改善，使细胞毒性物质的毒性作用减少；但由于高剂量胺碘酮引起睾丸细胞NOS活性增高，使睾丸组织生成NO的能力增强，造成血管持续舒张，组织耗氧量和细胞通透性增加，加重生殖系统的器官和组织的缺氧程度，降低细胞内ATP水平，抑制能量的生成，最终造成生殖系统的损伤及功能障碍。另外，精子富含不饱和脂肪酸[18,19]，易受NO引起的脂质过氧化介导的对细胞膜的损伤，抑制精子的活力，导致精子功能障碍。
综上所述，高剂量胺碘酮导致成年雄性大鼠睾丸形态改变、NOS活性增高、NO含量增加，精子活力下降，从而影响男性生殖功能。
参考文献
[1]Haverkamp W,Israel C,Parwani A.Clinical aspects of treatment with amiodarone[J].Herzschrittmacherther Elektrophysiol,2017,28(3):307-316.
[2]Gasparich J P,Mason J T,Greene H L,et al.Amiodaroneassociated epididymitis:drug-related epididymitis in the absence of infection[J].J Urol,1985,133(6):971-972.
[3]Nikolaou M,Ikonomidis I,Lekakis I,et al.Amiodarone-induced epididymitis:a case report and review of the literature[J].Int J Cardiol,2007,121(1):15-16.
[4]Takai S,Oda S,Tsuneyama K,et al.Establishment of a mouse model for amiodarone-induced liver injury and analyses of its hepatotoxic mechanism[J].J Applied Toxicol,2016,36(1):35-47.
[5]范甜甜,杨治峰,薄存香,等.农达对小鼠睾丸组织损伤和氧化应激的影响[J].现代预防医学,2018,45(2):319-323.
[6]穆杨,闫文杰,尹太郎,等.高脂饮食诱导大鼠生精功能障碍[J].医学研究杂志,2015,44(12):88-91.
[7]Odet F,Duan C,Willis W D,et al.Expression of the gene for mouse lactate dehydrogenase C(Ldhc)is required for malefertility[J].Biol Reprod,2008,79(1):26-34.
[8]Datta S,Chakrabarti N.Age related rise in lactate and its correlation with lactate dehydrogenase(LDH)status in postmitochondrial fractions isolated from different regions of brain in mice[J].Neurochem Int,2018,11(8):23-33.
[9]Yan-Feng C,Xiao-Xue Z,Lin-Da Z.Effect of lanthanum on testicular tissues and enzyme activities of testicles in mice[J].J Toxicol,2008,22(1):44-45.
[10]Millar A H,Eubel H,Jansch L,et al.Mitochondrial cytochrome C oxidase and succinate dehydrogenase complexes contain plant specific subunits[J].Plant Mol Biol,2004,56(1):77-90.
[11]赵海军,王宝贵,张桂英,等.硝酸亚铈对小鼠睾丸细胞酶活性和精子数量及质量的影响[J].中国预防医学杂志,2008,9(11):956-958.
[12]田洪艳,李质馨,徐冶,等.一氧化氮合酶与精子关系的研究概述[J].吉林医药学院学报,2005,26(1):50-52.
[13]田洪艳,李质馨,徐冶,等.蒺藜提取物对小鼠睾丸热损伤后NOS-NO系统的影响[J].中国男科学杂志,2014,2(11):14-18.
[14]杨丹,郑立宏,孙发,等.精液中NO浓度对男性生育的影响[J]中国男科学杂志,2016,30(5):718-720.
[15]You Min K,Jian Z,Jian L I,et al.Research advance in nitric oxide and nitric oxide synthase in testis[J].Bull Acad Milit,2002,4(5):25-28.
[16]Sagar S,Parida S R,Sabnam S,et al.Increasing NO level regulates apoptosis and inflammation in macrophages after2-chloro ethyl ethyl sulphide challenge[J].Int J Biochem Cell Biol,2017,8(3):1-14.
[17]Bain A R,Weil B R,Diehl K J,et al.Insufficient sleep is associated with impaired nitric oxide-mediated endotheliumdependent vasodilation[J].Athero sclero sis,2017,26(5):41-46.
[18]周鑫,夏欣一.精子质膜功能检测的研究进展[J]中华男科学杂志,2010,16(8):745-748.
[19]Beirao J,Zilli L,Vilella S,et al.Fatty acid composition of the head membrae and flagella affects Sparus aurata sperm quality[J].J Applied Ichthyol,2012,28(6):1017-1019.