17β雌二醇抑制丙泊酚诱导皮质神经元凋亡的机制

　　丙泊酚作为常用的静脉全身麻醉药，通过激动GABA 受体和抑制 NMDA 受体发挥麻醉作用，具有起效快、苏醒快、不良反应少等优点，广泛用于麻醉诱导和维持。丙泊酚是否适用于新生儿和婴幼儿的全身麻醉，目前观点不一。研究表明 GABA 受体在发育期大脑作为一种兴奋性神经递质，激动GABA 受体引起氯离子外流使细胞膜去极化，产生兴奋性神经毒性[1].最近动物实验研究表明，反复大剂量使用丙泊酚可对发育期动物大脑产生损伤，导致发育期动物大脑广泛脑区神经细胞凋亡的显着增加，甚至影响动物成年后的学习记忆功能[2,3].

　　体外细胞实验研究也表明丙泊酚具有发育期神经毒性，可诱导原代培养神经元凋亡[4,5].丙泊酚发育期神经毒性引起了众多学者的广泛关注，因此研究丙泊酚发育期神经毒性的发生机制以及寻找安全有效的措施防治丙泊酚发育期神经毒性已成为麻醉医师关注的重要课题。以往研究表明 17β 雌二醇作为一种内源性神经甾体可对 GABA 受体激动剂苯巴比妥和 NMDA 受体抑制剂 MK-801 和氯胺酮产生的发育期大鼠大脑损伤产生保护作用[6 -8].

　　17β 雌二醇是否对丙泊酚诱导的原代培养皮层神经元凋亡产生保护作用以及机制尚不清楚，本实验将从凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 及 cleaved caspase-3 水平变化等方面研究 17β 雌二醇抑制丙泊酚诱导原代培养皮质神经元凋亡的机制，以期为临床应用17β 雌二醇防治丙泊酚的发育期神经毒性提供实验依据。

　　1 材料和方法。

　　1. 1 材料。

　　丙泊酚 （ Diprivan,意大利 AstraZeneca 公司，批号： KW814） ,20%脂肪乳购自广州百特公司，DMEM培养液、胎牛血清、Neurobasal 培养液、B27 促生长剂购自美国 Gibco 公司，17β 雌二醇、DMSO 购自美国Sigma 公司，Hoechst 33258 和胰蛋白酶购自北京索来宝公司，TUNEL 试剂盒购自德国 Mannheim 公司，Bcl-2、Bax 及 cleaved caspase-3 抗体购自美国Cell Signal Technology 公司。

　　1. 2 方法。

　　1. 2. 1 皮层神经元原代培养： 取新生 24 h 内的 SD幼鼠（ 清洁级，体质量 5 ~ 6 g,雌雄不限，河北省实验动物中心提供，生产许可证号： SCXK（ 冀） 2008- 1003） 大脑额叶皮层组织，用冷 PBS 洗剂，剪碎，移入 0. 125% 胰蛋白酶中置于 37℃ 水浴锅内充分消化15 min,用含10%胎牛血清的 DMEM 培养基终止消化，吸弃上清液，然后把细胞转移到含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中用巴氏滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。然后经 100 目钢丝筛过滤，计数后按 1 ×109/ L 的密度接种于经多聚赖氨酸处理的培养板中，放于 5% CO2培养箱 37℃恒温培养 24 h后，全量换 Neurobasal + B27 培养基，以后每隔 2 d半量换液 1 次。体外培养 7 d 的神经元用于实验。

　　1. 2. 2 实验分组： 原代培养 7 d 的大鼠皮层神经元，随机分为 3 组： 溶剂对照组（ 给予等溶剂 20% 脂肪乳） ,丙泊酚组（ 丙泊酚终浓度为 500 μmol/L） ,17β 雌二醇 + 丙泊酚组（ 17β 雌二醇终浓度为 0. 1μmol/L,17β 雌二醇加入 2 h 后，给予丙泊酚，其终浓度为 500 μmol/L） .

　　1. 2. 3 Hoechst 33258 核染色法检测神经元凋亡：将神经元接种于 6 孔培养板中，按上述分组方法给予不同药物处理后，移去培养液，用 4℃ PBS 冲洗 3遍后，加入 4%多聚甲醛固定 30 min,去除多聚甲醛固定液，用冷 PBS 液冲洗 3 遍，加入 Hoechest 33258染色8 min,PBS 漂洗3 遍，荧光显微镜下随机选取5个视野进行形态学观察和计数，计算凋亡率。凋亡率（ %） = 凋亡细胞数/细胞总数 × 100%.

　　1. 2. 4 应用 TUNEL 法检测神经元凋亡： 应用TUNEL 法检测神经元凋亡 将细胞涂片用 4% 多聚甲醛室温下固定 30 min,然后 PBS 洗 3 次，0. 3%H2O2封闭内源性过氧化酶 30 min,然后在 0. 1%Triton X-100 的 0. 1% 柠檬酸钠溶液中 4℃ 孵育 5min,将 50 μL TUNEL 反应液在 37℃ 湿盒中反应 60min,PBS 冲洗 3 次，然后再加入 50 μL 可转变还氧化酶反应液，37℃ 湿盒中孵育 30 min,最后加入 50μL 底物反应液室温反应 10 min.光镜下观察神经元，细胞核有棕黄色颗粒者为阳性神经元，采取 5 个不同的视野，计算阳性和阴性细胞数量。

　　1. 2. 5 Western blot 法测定 Bcl-2,Bax 及 cleavedcaspase-3 蛋白水平： 细胞经各种处理后，收集细胞，用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，用 BCA 法检测蛋白含量。取待测蛋白质 50 μg 加上样缓冲液煮沸变性，于 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中 100 V 电泳 1. 5 h,转膜 2 h,加入 Bcl-2,Bax 及cleaved caspase-3 抗体（ 1: 2 000） ,4℃ 过夜，常规洗涤，加羊抗鼠二抗（ 1: 5 000） ,37℃ 孵育 60 min,洗涤，电化学法发光，显影，扫描，用凝胶图像处理系统分析目标条带与内参照条带吸光度的比值。实验重复 3 次，设 β-actin 蛋白为内参。

　　1. 2. 6 统计学方法： 数据应用 SPSS13. 0 统计软件进行数据处理，数据均用均数 ± 标准差（ mean ±s） 表示，以 P < 0. 05 为差异有统计学意义。采用单因素方差分析和 SNK 检验进行数据分析。