猪胃肠道微生物群落结构及多样性分析

　　摘要：我国作为畜牧业大国, 正在经历养殖动物健康和畜产品质量的升级。调节肠道菌群被认为是可以减少动物疾病的发生、提高饲料转化率及控制抗生素不当使用的有效手段。文章综述了微生物组技术在猪肠道微生物研究中的应用, 相信这些基础研究成果对实际生产养殖会产生有益的指导, 并进一步促进精准畜牧的发展和我国养殖业的总体水平的提高。

　　关键词：微生物组; 猪; 肠道微生物;

　　猪是我国畜牧业生产的重要组成部分, 建立适合开展猪胃肠道微生物组研究的技术体系, 系统深入揭示品种 (遗传型) 、饲养管理对胃肠道微生物组成和代谢的影响及途径, 研究胃肠道微生物与宿主的互作机制, 研发能够提高饲料资源转化利用效率和生产性能、增强胃肠道功能与宿主健康、提升养殖环境质量、改善肉产品品质的微生物组应用技术, 能显着降低或者消除抗生素使用量促进生态养殖, 整体提升我国畜禽养殖科技水平, 显着提高我国畜禽养殖效益、保障畜禽产品安全、改善生态环境、促进人类健康。

　　1 微生物组

　　微生物组是指一个特定环境或者生态系统中全部微生物及其遗传信息, 包括其细胞群体和数量、全部遗传物质 (基因组) , 它界定了涵盖微生物群及其全部遗传与生理功能, 其包括了微生物与其环境和宿主的相互作用。

　　2 微生物组的研究方法

　　微生物遍布于人体所有与外环境相通器官, 尤以肠道微生物数量众多, 对人体有着非常重要的生理意义。但因其种类繁多、体型微小, 增加了对其全面、深入认识的难度。随着分子生物学、基因组学、生物信息学等学科的兴起, 大大促进了微生物组研究技术的发展。微生物组研究的重点:一是多样性, 包括分离、鉴定种类及定量;二是活性, 即微生物在其所处环境中起何种功能作用。围绕这一主题, 微生物组研究方法可概括为传统检测方法、构建基因文库法、遗传指纹图谱技术、分子杂交技术和DNA测序技术等。

　　高通量测序技术的发展使得研究者可以在对不同生态位的微生物群落结构和功能进行整体研究与分析, 宏基因组学技术相比于之前研究方法具有很强的优越性, 它能够获得更加全面的微生物群落信息, 帮助人们把握猪微生物组的全貌。目前常用的高通量测序方法主要是以Illumina公司发展的为代表的第二代测序方法, 以及以Pacbio公司为代表的第三代单分子测序方法。通过结合微生物分离培养与高通量扩增子测序, 宏基因组测序 (shot gun) 以及宏转录组测序, 从而对猪微生物组进行全面的群落结构与多样性分析, 功能基因注释与预测分析, 在特定时空条件以及不同条件处理的基因表达情况分析来全面揭示猪微生物组与健康, 猪病发生与防治, 促进仔猪生长的关系。

　　3 猪肠道微生物的形成

　　仔猪肠道微生物区系随宿主日龄增加逐渐变得复杂多样, 且形成一个相对动态平衡、稳定的微生态系统, 对宿主的生长和健康起着重要作用。

　　猪在出生前胃肠道没有细菌, 出生24 h内, 肠道内定植了双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌等细菌。随着日龄的增长, 微生物的多样性与丰富度随之提高。育肥猪肠道内以厌氧菌 (双歧杆菌、乳酸菌等) 为主, 约占99%, 少量为需氧菌或兼性厌氧菌。定植在宿主肠道内的微生物及其代谢产物能够不同程度地影响营养物质的消化、吸收、利用。同样, 不同的膳食水平也会制约着微生物的生长与增殖。营养物质与微生物之间存在着互作机制, 相互影响, 共同进化, 维持着肠道微生态平衡。

　　4 微生物组的应用

　　4.1 猪胃肠道微生物群落结构及多样性分析

　　地球上存在超过55个细菌门类, 但只有拟杆菌门和厚壁菌门这两个深层进化门类的菌群在胃肠道中占优势, 这表明动物胃肠道是一个相对独立的环境, 其微生物组成与其他生态环境有明显差别。

　　Lamendella等 (2011) 对猪粪便微生物宏基因组进行shotgun测序的研究表明, 猪粪便微生物中占主导地位的是厚壁菌门和拟杆菌门, 其中Prevotella spp.占优势, 与其他动物宏基因组数据的比较发现, 猪粪便菌群的门类分布与牛瘤胃和鸡盲肠最为相似。Yan等 (2015) 在长白猪与梅花猪仔猪的研究中发现相比于梅花猪, 长白猪仔猪的结肠粘膜中短链脂肪酸转运蛋白及受体的表达更高, 而胆汁酸受体表达更低;鉴定出8个细菌属及16个细菌物种, 在2种仔猪结肠中的相对丰度存在差异, 这些细菌与结肠胆汁酸及短链脂肪酸的浓度密切相关。Ramayocaldas等 (2016) 利用网络分析的方法首次揭示了猪肠道菌群的相互作用, 构建了以属水平微生物和OTU为单位的相互作用网络, 并与人肠道菌群的相互作用进行了比较。对518头60日龄健康仔猪的肠道菌群进行聚类, 并结合体重和平均日增重等产量性状, 利用Arumugam等开发的肠型分析算法对518个小猪样品的肠道微生物进行分析, 结果显示小猪肠道菌群主要分为2个类似肠型的类型:第一类为PEA, 密螺旋体属是PEA聚类群的优势菌;第二类为PEB, 普氏菌属是PEB聚类群的优势菌。聚类结果与小猪的平均日增重相关 (P=0.027) , 不受小猪的性别、生产批次及核心家族影响。

　　4.2 猪不同发育阶段胃肠道微生物的变化研究

　　动物胃肠道正常微生物区系在动物营养、健康、防病、免疫等方面发挥着重要作用。仔猪哺乳阶段是肠道菌群快速建立的阶段, 而断奶会导致仔猪肠道菌群发生巨大的改变。猪肠道内含有细菌、真菌、病毒等多种微生物, 种类不同的微生物按照一定的比例组合, 各微生物间相互协同与拮抗, 在质和量上形成一种生态平衡。在人体微生物组研究中, 已有从婴儿到老年时期不同年龄的人体菌群变化研究。那猪的肠道菌群随年龄如何变化?

　　Chen等 (2017) 探讨了猪不同年龄的肠道菌群结构变异, 分别在仔猪断奶前10天, 断奶日, 断奶后10天, 断奶21天收集新鲜粪便, 通过16S测序分析表明仔猪在断奶后, 肠道菌群快速改变, 并在10天内达到相对稳定的水平, α多样性随时间增长显着增加;仍在接受哺乳的仔猪的肠道菌群主要由梭杆菌属、乳杆菌属、拟杆菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属、巨型球菌属组成;断奶后的仔猪的肠道菌群主要由Blautia、梭菌属XIVa、Paraprevotella等菌属组成。Zhao等 (2015) 选取1个月、2个月、3个月以及6个月大的猪作为试验对象, 检测微生物在猪肠道中的动态变化, 结果表明高年龄段猪粪便中厚壁菌门微生物比例显着高于低年龄段, 并且在猪发育过程中, 微生物组成趋于稳定;在成年猪中, 肠道不同位置微生物组成差异显着。PCA主成分分析结果表明1月大猪中微生物组成与其他三个年龄段显着不同, 而6月大猪的不同胃肠道样本可因属水平微生物组成聚为3类:小肠 (空肠和结肠) 、大肠 (回肠和盲肠) 和粪便。Koenig等 (2011) 关于婴儿肠道微生物的研究指出儿童肠道微生物群落在2.5岁后基本趋于稳定。高通量测序的宏基因组技术为研究各个发育阶段微生物提供了充足的数据支持, 使得整个发育阶段微生物变化脉络更加清晰完备, 且研究更加简单易行。

　　4.3 猪肠道微生物与机体营养代谢

　　4.3.1 日粮组成对猪胃肠道微生物的影响

　　近年来, 动物科学家开始对动物饲养策略的优化以及动物健康状况的改善进行深入的微生物组研究。Tilocca等 (2017) 采用16S r RNA基因测序和宏蛋白组学方法对饮食改变引发的猪粪便微生物群的结构和功能变化进行分析, OTU丰度和蛋白质定量分析发现, 以第一天为零点, 第1、2周为代谢期, 第3、4周为平衡期;仅在平衡期时, 菌群因Ca P的添加量不同而表现出显着差异;以大豆或豌豆作为不同蛋白来源的饲料对菌群无显着影响;随着食物结构的改变, 菌群的组成和功能在数周内逐渐重排, 对营养学研究具有重要意义。

　　膳食蛋白质是家畜氨基酸的基本来源。以前的研究报告指出低蛋白饮食可以降低猪粪便和尿液中氨-氮的浓度, 但它对生长性能和肠道健康的影响还没有得到充分验证。Fan等 (2017) 在调查膳食蛋白水平对肠道细菌群落和肠道屏障的影响中发现, 适度减少膳食蛋白质浓度 (13%CP) 可以改善成品猪回肠和结肠中的细菌群落结构, 增加Peptostreptococcaceae的比例, 回肠屏障功能增强, 并解释了由不同浓度的膳食蛋白质引起的肠道细菌综合变异的基本机制, 指出特定营养物质要达到一个平衡比例, 可能才是最有利于机体和相关菌群所需的。

　　猪胃肠道微生物稳态受多方面的影响, 其中不同日粮组成对肠道微生物影响显着。在日粮组成对猪肠道微生物影响的相关研究方面, 采用基于高通量测序的宏基因组技术, 对不同日粮处理的猪肠道样本检测后, 可获得远多于传统方法的大量微生物的生物学信息, 便于更准确的分析日粮与肠道微生物的关系。

　　4.3.2 饲料添加剂对猪胃肠道微生物的影响

　　饲料添加剂是指在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质, 在饲料中用量很少但作用显着。饲料添加剂是现代饲料工业必然使用的原料, 对强化基础饲料营养价值, 提高动物生产性能, 保证动物健康, 节省饲料成本, 改善畜产品品质等方面有明显的效果。Yu等 (2017) 的研究中, 在对照饮食, 高Zn O (3000mg/kg) 或抗生素 (300mg/kg金霉素和60mg/kg硫酸粘杆菌素) 喂养的仔猪的回肠和结肠进行微生物群落分析, 结果显示断奶仔猪的日粮中补充高氧化锌 (Zn O, 3000 mg/kg) 或抗生素, 均可显着增加回肠螺旋体门、柔壁菌门、广古菌门、疣微菌门和TM7门数量, 降低衣原体门数量;相比对照组, Zn O和抗生素组的回肠菌群中, 条件致病菌弯曲菌目数量降低, 肠杆菌目数量增加;Zn O组的结肠菌群中, 广古菌门、甲烷短杆菌属、史氏甲烷短杆菌种显着高于其他组;饮食中高含量的Zn O和抗生素增加回肠菌群多样性且效果相似, 影响非主要菌群, 并降低结肠菌群多样性。

　　果胶包含3种不同类别的多糖:半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖和替代半乳糖醛酸聚糖, 其特点是较高的保水能力、黏性和缓冲能力, 在盲肠不被酶解, 并且可在后肠发酵, 有助于减少仔猪肠道末端未被消化的饲料, 从而降低病原菌增殖。而日粮中添加果胶的效果取决于所添加的果胶的理化特性, 或间接取决于其对肠道发酵和菌群调控的影响。Tian等 (2017) 通过16S测序研究三种不同果胶对其他碳水化合物消化、猪肠道菌群组成和短链脂肪酸水平的影响, 发现LMP显着降低淀粉的回肠消化效率, 导致更多淀粉在近端结肠发酵;在回肠, LMP比HMP更容易被菌群发酵, HMP主要是被近端结肠的菌群发酵;大豆粉主要在近端结肠发酵, 引起横结肠中SCFA水平升高;LMP, HMP和a SBM降低结肠乳酸菌和增加普氏菌的相对丰度, 这可能对身体有益。

　　4.4 抗生素对猪肠道微生物的影响

　　肠道微生物菌群通过定植肠道, 增加抵抗力, 帮助机体防御病原菌的入侵。也可通过增强机体对病原菌的免疫应答和阻止病原菌在肠道的附着, 帮助机体免受外来病原菌感染。研究证实, 无菌动物比肠道内微生物菌群正常的动物更容易遭受病原菌感染, 因此抗生素可能是通过抑制某些有害菌, 从而给更多有益菌增加了繁殖的空间, 最终发挥作用。

　　Looft等 (2014) 通过16S r RNA基因序列和宏基因组分析揭示了进食抗生素对不同肠道位置的微生物群的影响, 发现在回肠中富集厚壁菌门和噬菌体编码基因, 而大肠微生物群则编码了许多降解植物细胞壁的基因, 回肠粘膜比内腔的微生物多样性更丰富, 且与大肠粘膜相似, 表明大多数肠道微生物可与粘膜结合, 抗生素喂养的动物的微生物群体显着的变化是回肠中的大肠杆菌, 所有肠道位置中的拉氏梭菌属以及抗生素的抗性基因的增加, 在不同肠道位置。对不同的代谢能力和反应进行描述, 将有助于提供改善肠道健康和食品安全的策略。未来的工作应该超越遗传变化, 对基因表达的影响, 甚至是蛋白质和代谢物的影响。此外, 系统生物学对于将微生物变化与宿主改变相结合至关重要。关于在农业中使用抗生素的争议可能会持续下去, 但了解抗生素如何影响肠道细菌群落, 可能会提供保留性能优势的替代策略, 同时降低对人类和动物健康的潜在风险

　　5 小结

　　肠道微生物自身及其代谢产物调控着机体的生理机能与健康水平, 对猪的生长与发育至关重要。利用微生物组研究猪肠道内微生物定植和演替规律, 分析微生物代谢产物产生和排放的规律, 揭示调控宿主肠道稳态和功能的作用机制, 进而开发营养调控消化道微生物定植和肠道功能技术, 将极大提高动物的生产和健康水平, 防控相关疾病的发生。相信随着微生物组研究水平的不断提高, 畜禽肠道微生物与肠道健康的互作机制将逐步被揭示, 也将为动物健康饲养策略的制订、技术与产品的开发提供坚实的理论基础, 为动物科学生产及微生物发酵等相关领域的研究工作提供科学指导。