固有免疫防御感染中血清淀粉样蛋白A的影响

　　摘    要：　血清淀粉样蛋白A(SAA)家族由SAA1至SAA4 4个蛋白组成。作为急性时相反应（APR）蛋白，在机体受到创伤和感染等激发因素时，SAA1和SAA2可在血清中急剧增加，SAA可作为多种疾病诊断、预后和治疗的生物指标。SAA在机体各个组织中均可表达，在感染、固有免疫应答和非特异性炎症过程中具有多种作用。SAA的部分生物学功能目前尚未完全明确，但其在宿主防御中的重要作用已较为确定。近年来随着SAA研究的深入，发现其在感染免疫多种途径中发挥作用。本综述重点介绍SAA在固有免疫防御感染中的作用机制，对近10年SAA的重要进展进行综述，尤其是5年内的相关进展。

　　关键词 :     血清淀粉样蛋白A;急性时相反应;感染;固有免疫; SAA激活序列; SAS激活因子;

　　Abstract：　Serum amyloid A(SAA)protein family consists of 4 protein molecules from SAA1 to SAA4. As acute phase reaction(APR)proteins,SAA1 and SAA2 are increase dramatically in serum when the organism is subjected to stimuli factors such as trauma and infection. SAA can be used as a biomarker in diagnosis,prognosis and treatment for many diseases. SAA are proteins found in all tissues of life with a plethora of biological functions,especially in infection process,innate immune response,and nonspecific inflammation. Biological function of SAA is undetermined but its role in host defense is obvious. In recent years,with the sin-depth investigate on SAA,it has been found that it plays a role in infection immunity through various pathways. In this review,we highlight the most important interconnections between SAA and immunity,focusing on host defense against relevant infections and on the SAA mechanism of innate immunity. In this opinion article,an overview of the most important developments of SAA in the last decades with a focus on the last five years is given.

　　Keyword：　Serum amyloid A(SAA); Acute phase reaction; Infection; Innate immunity; SAA-activating sequence; SAS-activating factor;

　　SAA蛋白家族是一类高度保守的血清成分，其病理生理学机制已研究了近70年。最初的临床和实验研究中，这种分子被认为是淀粉样变沉淀物中的一种成分。淀粉样变病理改变在光镜下的特征是无固定界限，可被刚果红或硫黄素T等染料染色；电子显微镜下可见淀粉样变呈纤维样结构。在慢性或复发性感染及非特异性炎症时可形成继发性淀粉样病变。最初研究时认为，淀粉样变独特的纤维蛋白（通常为约76个氨基酸组成的蛋白序列）是淀粉样蛋白A(amyloid A,AA）。后发现AA蛋白是由一个序列更长的血清蛋白（约104个氨基酸组成）水解而来，即现在所称的血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)[1]。
 

　　1 、SAA的基因

　　在哺乳动物及其他脊椎动物的进化过程中，SAA呈高度保守基因序列。大样本人群研究已经确定SAA存在基因多态性，并据此提出分类方法，但多数编码SAA的基因组仅为单个核苷酸的变异（single nucleotide polymorphisms,SNP)[2]。SAA基因可在各种急性时相反应（acute phase reaction,APR）蛋白诱导刺激下转录，包括：IL-1β、IL-6、TNF-α和MAPK活化分子（如：pERK1/2、pJNK、p38）以及腹腔内酪蛋白和脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）等。炎症初期，SAA mRNA的水平会急剧上升。升高的SAA最终会逐渐分解。saa1,saa2,saa3和saa44个人类不同编码基因聚集在11号染色体的p15.1区域，长度为150 kb。其基因在染色体上排列按顺序分别为saa1、saa2、saa4、saa3。除saa3基因有3个外显子2个内含子，其他基因均包含4个外显子和3个内含子[3]。saa1和saa2基因包含saa1α、saa1β、saa1γ、saa2α和saa2?等位基因[4]。saa2α和saa2?基因分别与saa1α第12和第13位核苷酸不同。除第71位密码子的单碱基取代（腺嘌呤替换为鸟嘌呤），saa2α和saa2?的核苷酸序列基本相同，因此，二者可能有相同的基因进化过程[5]。saa基因的启动子区域包含NF-κB(GGGACTTTCC）和NF-IL6(AGGT-TACACAACTG）转录因子识别序列，IL-1、IL-6、TNF及SAA激活序列（SAA-activating sequence,SAS）可诱导SAA的启动子激活，其中SAS激活因子（SAS-activating factor,SAF）的结合位点是SAS[6,7]。

　　2、 单体SAA和纤维结构

　　单体SAA的三维结构特点为4个α螺旋和1个C端结构域[8]，单体SAA中未发现存在β-折叠。SAA单体结构主要在血清中表达，组织中沉积的淀粉样蛋白一般并不包含SAA单体结构。多种淀粉样纤维存在共同的结构特征，最显着的特征是呈上下β折叠堆砌薄片结构（通常是逆向平行），并通过广泛的氢键和范德华作用力维持相互稳定。淀粉样蛋白纤维直径20 nm，在堆叠的薄片之间有10?空隙。有报道显示SAA纤维可有长短不同的形式。大多数SAA纤维均包含相同的N端76个氨基酸残基。由于SAA单体结构中不存在β-折叠结构[8]，因此在组装纤维之前必须对一级结构进行重组。

　　AA和其他类型的淀粉样纤维均具有难以分解的特性，因这些特性造成细胞与细胞间的通讯、营养和离子输送障碍以及器官微结构的改变。

　　3、 SAA与特定受体的结合

　　SAA可与特定的细胞或大分子结合，如LPS。SAA与大肠杆菌的外膜蛋白A(outer membrane protein A,ompA）结合可增强中性粒细胞对细菌的吞噬功能，起调理素的作用。

　　SAA的细胞受体比较复杂，多个研究的结论不尽相同，也反映了SAA可能具有多种不同的生理功能。SAA与清道夫受体B1(scavenger receptor B1,SR-B1）结合主要参与了巨噬细胞对胆固醇的摄取；与Toll样受体（Toll like receptor,TLR)2结合可激活炎症小体NLRP3并诱导炎症因子的产生和释放；与TLR4结合可激活NF-κB、转录因子活化蛋白-1(activate proteins,AP-1）以及一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase,NOS）；与甲酰肽受体样受体1(formyl peptide receptor-like receptor 1,FPRL1）结合可刺激基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9）；与甲酰肽受体（formyl peptide receptor 2,FPR 2）结合可促使吞噬细胞迁移；与糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）结合可激活NF-κB，并诱导细胞因子产生；与细菌受体直接结合可对革兰氏阴性菌起调理作用[1]。

　　SAA参与多种病理生理功能。除SR-B1参与胆固醇的转运外，SAA与多种受体结合主要参与机体感染的过程。

　　4、 SAA在固有免疫防御感染中的作用

　　因SAA1与SAA2主要参与APR，在APR期间蛋白浓度可比正常水平升高约100～1 000倍，因此被称为急性期SAA(acute-phase SAA,A-SAA），可激活免疫防御[9]。作为参与固有免疫的一种成分，A-SAA在机体抵御各种病原体侵袭的过程中起重要作用。

　　4.1、 SAA与细菌感染

　　HARI-DASS等[11]研究结果显示，A-SAA可直接结合几种革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌和铜绿假单胞菌等。质谱仪分析发现，A-SAA的配体OmpA几乎存在于所有革兰氏阴性细菌中。有研究采用盲肠结扎和穿刺（cecal ligation and puncture,CLP）导致急性多菌群败血症，并建立小鼠APR蛋白诱导模型，在CLP后第5天约有75%小鼠仍存活。肝特异性gp130基因纯合子缺失的小鼠模型CLP后，因无法合成SAA出现90%的致死率，当给予外源性SAA治疗后，小鼠生存率可得到恢复。此外，经抗SAA的33-43基因编码片段蛋白的单克隆抗体处理后，也可导致小鼠约90%的高致死率。该研究证明了SAA对急性感染败血症小鼠的生存具有保护作用[12]。革兰氏阴性细菌感染引起的组织损伤和脓毒症的主要炎性介质是LPS，而LPS是诱导SAA强烈表达的外源性因子。近期美国伊利诺伊州大学CHENG等[13]研究证明，急性期SAA1为LPS诱导的炎症和组织损伤提供了保护。研究采用表达人SAA1转基因小鼠CLP模型，腹腔注射LPS导致炎症反应，研究发现，表达人SAA1转基因小鼠对LPS造成的肺损伤有部分保护作用，但并不能削弱TNF-α诱导的肺部炎症和损伤。小鼠SAA1表达水平与血清和肺组织中的LPS浓度呈负相关；SAA1可直接与LPS结合形成复合物，并促进巨噬细胞摄取LPS。此外，致病菌侵袭小鼠肠黏膜上皮可诱导产生A-SAA，具有保护肠道正常菌群的作用[14]。A-SAA与细菌结合具有调理巨噬细胞和嗜中性粒细胞的作用，可促进和增强吞噬作用、促进TNF-α和IL-10的分泌以及嗜中性粒细胞呼吸爆发。机体正常浓度的A-SAA也具有上述作用，推测A-SAA可作为模式识别蛋白参与抵御病原体入侵宿主的第一道防线。

　　4.2、 SAA与病毒感染

　　A-SAA在宿主抗病毒中也起重要作用。研究报道，SAA可通过抑制丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）复制和阻止病毒进入细胞，具有抗病毒活性作用。该研究将人重组SAA蛋白与HCV混合后体外感染肝脏细胞，发现SAA以剂量依赖的方式抑制了HCV的感染，浓度为50～100?g/ml的SAA可完全抑制HCV感染，HCV NS3蛋白和正链RNA的水平与SAA浓度呈负相关。HCV E2糖蛋白与人CD81、SR-B1和低密度脂蛋白受体等肝脏细胞表面分子相互作用，SAA可与SR-B1特异性结合，因此认为SAA与SR-B1的结合是干扰HCV感染的原因之一[15]。SAA阻止HCV感染的确切作用机制仍有待研究，但SAA通过特异性阻断HCV感染，表明SAA可能在抵抗HCV感染的宿主固有免疫中起重要作用。SIDORKIEWICZ等[16]研究发现，在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV)X蛋白转基因小鼠中，X蛋白完全抑制了A-SAA应答，A-SAA作为一种抗病毒物质可能对去除X蛋白后的HBV复制和清除具有治疗作用。

　　4.3、 SAA与真菌感染

　　多项研究证明，A-SAA对真菌感染也具有潜在的固有免疫调节作用。在白色念珠菌全身感染期间，A-SAA浓度可能在数小时内增加至500?g/ml。高浓度的A-SAA可通过诱导多形核（polymorphonuclear,PMN）细胞脱颗粒和吞噬作用来启动和增强抗念珠菌活性。实验研究表明，以50?g/ml的SAA孵育PMN也可增强抗真菌活性，SAA激活PMN以剂量依赖性方式抑制念珠菌生长。目前认为SAA抑制真菌生长的作用是通过激活PMN中G偶联蛋白介导的信号通路增强巨噬细胞表面抗原表达（上调CD11c和CD16）和促进乳铁蛋白分泌完成的[17]。

　　4.4、 SAA与炎症信号通路

　　SAA的多种作用提示该APR蛋白可与多种受体相互作用并激活炎症信号通路，SAA与FPR2和G偶联蛋白受体结合是多种免疫细胞的激动剂[18]。缺乏FPR2受体的炎症细胞给予外源性SAA，可增强这些细胞的迁移能力，在SAA刺激下激活NF-κB，并产生趋化因子和IL-8等炎性介质[19]。两项独立的研究表明，SAA可以激活TLR，包括：TLR2和TLR4[20]。其中一个研究证明TLR2/1异二聚体是SAA的首选受体。SAA刺激这两种受体诱导了MyD88信号传导，包括ERK和p38MAPK的磷酸化，并导致IL-1β、TNF-α、IL-12p40和IL-10的转录激活，以及增加NO生成[21]。TLR2同时介导SAA诱导的IL-23p19和G-CSF的表达[22,23]。近期研究显示，TLR2的激活有助于SAA诱导的IL-33和M2巨噬细胞标志物的表达[24]。

　　4.5、 SAA与单核-巨噬细胞

　　各种炎症均可激发外周血SAA增加。人类SAA蛋白家族SAA1、SAA2和SAA4均可激活大量固有和适应性免疫细胞。有研究检测了人原代单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞在转录和蛋白水平上表达SAA1、SAA2和SAA4的能力。采用单独给予LPS或LPS联合皮质类固醇孵育健康供体的单核细胞和衍生的巨噬细胞，在检测SAA表达水平的同时，测定前炎症因子IL-1α、IL-1β和IL-6的表达。研究发现，单独LPS并无诱导人单核细胞和巨噬细胞中saa1和saa2基因转录的作用，而LPS与地塞米松联合可诱导saa1和saa2基因的转录。单独LPS刺激可强烈诱导人单核细胞和巨噬细胞前炎症因子的释放，而地塞米松则起抑制作用。此外，在极化的M1表型单核细胞中，LPS与地塞米松联合使用可导致以SAA1为主的表达增强，SAA mRNA和细胞内SAA蛋白水平存在较大差异，炎症刺激人的单核细胞和巨噬细胞可表达saa基因，主要是saa1基因。LPS与地塞米松联合激发单核/巨噬细胞后，前炎症因子IL-1α、IL-1β和IL-6表达下降，而SAA蛋白表达水平显着增高。由于单核/巨噬细胞是慢性炎症性疾病的主要炎症细胞，因此推测巨噬细胞产生的SAA可能主要参与了局部炎症的微环境，如致密组织肉芽肿和结节样病变[5]。

　　4.6、 saa基因与炎症因子

　　以往研究发现人类saa1和saa2基因共用了APR基因表达谱，它们可由TNF、IL-1、IL-6和IFN等多种炎症因子刺激诱导表达。BUCK等[10]研究回顾了肝细胞来源的SAA。IL-1β诱导和SAA与NF-κB基因位点结合显着抑制了紧邻NF-κB旁的C/EBP位点的识别。在炎症因子刺激24～36 h后，血清SAA水平可升高1 000倍，后可迅速下降，提示SAA存在显着的调节和反馈机制，但这种调节和反馈假设机制目前仍未完全清楚，现有主要的理论依据来源于小鼠模型。在固有免疫细胞（如：促炎型或M1表型的巨噬细胞）表面的模式识别受体（pattern recognition receptors,PAMP）与细菌感染性败血症的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMP）可被TLR识别，导致NF-κB活化、T细胞启动和炎症因子的分泌[25]。在APR早期所有刺激因子中，IL-6对APR蛋白基因转录是最有效的。在小鼠saa 280～224 nt基因片段发现的3个同源的富含嘧啶的8个核苷酸组成的基序（CACCGTCA,CACCCACA,CAGCCCCC）可与SAF发生特异性反应。这些基序突变可减少肝外细胞对IL-6诱导产生SAA的能力。SAF是由477个氨基酸组成的锌指蛋白，在炎症过程中发生磷酸化，saa-1转基因小鼠可产生显着的淀粉样蛋白沉积病变。具有与gp130受体结合的其他炎症因子可部分替代IL-6缺失，并产生SAA。2个gp130受体组成的信号复合物可在细胞内磷酸化，并激活STAT3和/或MAPK信号。IL-6受体的抗体可部分阻断APR蛋白产生，IL-1受体拮抗剂或抗TNF抗体也可部分抑制APR蛋白产生的作用。小鼠肝脏细胞特异性的gp130受体缺失可最大程度抑制APR蛋白的合成，提示SAA和CRP合成过程中该受体对肝脏细胞内信号传导途径也十分重要[26]。SAA的促炎和抗炎活性已有多个研究。SAA最显着的促炎活性为诱导趋化因子和直接趋化白细胞，这两种情况均发生在低浓度的SAA(10 ng/ml）状态。SAA通过与G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCR）或FPR 2结合，导致单核细胞、未成熟树突状细胞（dendritic cells,DCs）、中性粒细胞和T细胞趋化。尽管这种直接趋化活性通常较弱，但SAA1-α能通过与TLR2结合，诱导CC和CXC趋化因子（如CCL3和CXCL8），并极大地增强单核细胞和中性粒细胞迁移[4]。人类外周血单核细胞和小鼠髓源性巨噬细胞暴露于SAA，巨噬细胞可表达M2标志，包括：IL-10、Ym1炎症区1（即：found in inflammatory zone-1,fizz1）、甘露糖受体C型1(mannose receptor C type 1,MRC1）、白介素-1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist,IL-1RA）和CCL17等。SAA还能增强精氨酸酶1(arginase 1,Arg1）活性，促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞。SAA诱导M2型巨噬细胞依赖于MyD88信号通路，同时也需要IFN调节因子-4(IFN regulatory factor-4,IRF-4）的辅助。有研究表明，小鼠腹腔注射25 ng人的SAA可上调腹膜巨噬细胞中IL-10、IL-1RA、fizz1-1、CCL17、MRC1和Arg1的mRNA表达[27]。单核细胞培养加入SAA，也可诱导细胞分化并产生IL-6、IL-1及M2巨噬细胞标志物IL-10和CD163。在小鼠体内，SAA诱导可使CD11bhigh和CD11chigh表达细胞扩增，在LPS刺激后可增加IL-6、IL-1β和GM-CSF表达水平[19]。

　　4.7、 SAA与中性粒细胞的氧化呼吸爆发

　　SAA的另一种抗炎活性是抑制中性粒细胞的氧化呼吸爆发，SAA可抑制趋化因子多肽N-甲酰-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯甲丙氨酸（N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP）激发的中性粒细胞的活性氧释放，但不能抑制佛波醇酯（phorbol myristate acetate,PMA）刺激引起的中性粒细胞的活性氧释放。此外，只有低浓度的SAA(100 ng/ml）才具有这种作用，而SAA≥50?g/ml反而能激发中性粒细胞氧化呼吸爆发，这表明在病理状态下，SAA调节了中性粒细胞从抗炎转化为促炎的作用模式[28]。此外，有研究证明，小鼠SAA≥20?g/ml可通过抑制巨噬细胞与T细胞相互作用，或诱导巨噬细胞及T细胞产生抑制因子来抑制小鼠抗体的产生[29]。

　　总之，SAA作为固有免疫的一部分，对防御机体感染起重要作用，包括对革兰氏阴性杆菌、病毒和真菌等。SAA通过与受体结合激活了炎症相关信号通路，同时也增加了固有免疫细胞的趋化和迁移。但在生理情况下或当机体受到病原体侵袭时，不同浓度SAA的界限及病理生理功能仍不明确，有待进一步深入研究。

　　5 、小结

　　最初研究发现SAA主要参与APR蛋白生成及慢性炎症中病理性纤维的产生，但目前研究表明，SAA在创伤、感染性疾病、代谢性疾病、心脑血管疾病、自身免疫性疾病和肿瘤多种等病理过程中发挥不同作用。本文阐述了SAA基因、结构及其受体相关内容，着重说明SAA在固有免疫防御感染中的作用。SAA在革兰氏阴性菌和真菌感染中具有明确的机体保护作用；在HCV感染中SAA具有抗病毒活性，但在其他病毒感染中并未显示其作用。此外，SAA在支原体、衣原体和立克次氏体等感染中的作用机制，以及对固有免疫和适应性免疫的作用机制均未见相关研究报道。SAA在临床上与血常规和CRP组成了“新三大常规”，能很好地对感染性疾病进行快速鉴别，但对SAA的病理生理和固有免疫中的作用仍未完全明确，尤其SAA在支原体、衣原体和立克次氏体等感染中增高的作用机制研究存在空白，可能是今后课题研究的方向。

　　参考文献

　　[1]JR SACK G H.Serum amyloid A-a review[J].Mol Med,2018,24(1):46-63 :DOl:10.1186/s10020-018-0047-0.