螺菌黄质系合成途径中6种Car的的定性定量分析

    摘要：【目的】针对不产氧光合细菌（APB）类胡萝卜素（Car）标准品缺乏的问题，以替代标准品实现螺菌黄质系多种Car组分同步、快速、准确的定量分析。【方法】以沼泽红假单胞菌CQV97为材料，采用吸收光谱、薄层层析和HPLC等方法制备螺菌黄质系Car标准品；以柠檬黄和番茄红素为替代标准品，采用HPLC法，建立了螺菌黄质系Car多组分的定量方法。【结果】制备的6种Car标准品纯度达95%以上。确定了Car的HPLC分析条件，以Car标准品为对照，得到了螺菌黄质系6种Car组分的定性HPLC指纹图谱。在选择的HPLC条件下，测定了6种Car标准品和2种替代标准品的标准曲线，确立了2种替代标准品分别与6种Car标准品之间的定量校正函数关系，并用于实际样品YL28和CQV97菌株的Car定量分析。采用Car标准品法测定的6种Car含量的RSD小于1.5%、回收率在96%-104%,替代标准品法与Car标准品法测定结果吻合，其相对误差小于0.1%.【结论】通过替代标准品校正函数关系，建立了2种准确定量分析螺菌黄质系Car多组分的方法。替代标准品柠檬黄和番茄红素均能准确地传递待测Car的量值关系，实现了螺菌黄质系6种Car的同步、快速、准确的定量分析，弥补了现有Car组分相对定量方法的不足。讨论了替代标准品法校正因子适用范围的局限性，提出了校正函数关系的思路和方法。这为全面实现APB球形烯系、奥氏酮系等其它Car的快速、准确定量分析提供了借鉴和参考。
   
    关键词：定量分析，类胡萝卜素，螺菌黄质系，替代标准品
   
    不产氧光合细菌（APB）含有丰富多样的类胡萝卜素（Car）。除具有抗氧化和光保护作用外，Car在光能的吸收、传递以及稳定光合作用机构-色素蛋白复合体（PPC）结构方面也具有举足轻重作用，近年来，它与光合作用效率的关系以及环境适应性调控机制备受关注；此外，在控制APB产品质量方面，Car也可作为重要评价指标，因此，系统开展Car分析在光合作用机理及应用研究中具有重要意义。目前，基于标准品的HPLC快速分析技术已应用于Car组分的定性和定量分析，但主要集中是源于高等植物、真菌、藻类和蓝细菌等Car组分的测定，对于APBCar的测定，目前仅局限于番茄红素、链孢红素、球形烯、奥氏酮、绿菌烯等少数几个种，由于标准品的缺乏，极大地限制了多组分Car的快速准确的定量。在标准品缺乏下，APBCar组分的定性分析主要依赖于HPLC、吸收光谱、质谱赵春贵等：替代标准品校正函数法定量分析不产氧光合细菌螺菌黄质系类胡萝卜素。
   
    与此相比，APBCar多组分的定量分析则相对薄弱，目前常用方法主要包括以一种Car对照品对各Car组分进行表观定量、基于HPLC色谱峰面积的相对定量、峰面积与摩尔消光系数（εmax）或平均εmax的比值的相对定量等。虽然这些方法在APB光合色素代谢与调控等研究中发挥了重要作用，但尚未实现绝对定量。
   
    替代标准品法亦称为“一测多评法”,是解决对照品紧缺、难以获得、检测成本高等问题的良好策略，已编入2010年版《中国药典》，目前已用于中药材等有效成分组的分析，例如以丹参素钠为替代标准品，用于测定丹参中原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B等4种化合物。替代标准品法的原理是：以替代标准品作为各待测组分的对照，在一定的线性范围，各待测组分的量与检测器响应信号成正比，通过比较待测组分标准品与替代标准品的标准曲线，求出替代标准品与各待测组分间的校正因子（RCF），并把它作为一个常数用于待测组分含量的测定。从方法的原理上分析，替代标准品法能够解决Car标准品缺乏问题，为APBCar多组分分析提供了可行性。但在APBCar分析过程中，某些Car的标准曲线并不是过原点的直线，采用校正因子（RCF）法测定的结果差异较大，因此，我们依据替代标准品法的思想，提出了校正函数的方法，其依据是：假如A和B为2种物质，在给定的测定条件下，假如它们的标准曲线均为不过原点的直线，其方程分别为（1）SA=kA·mA+bA和（2）SB=kB·mB+bB,其中S、m、k和b分别为检测信号、物质的质量、线性方程的斜率和纵截距。假定A作为B的替代标准品，当SA=SB时，通过方程（1）和（2）导出mA与mB的关系式，即方程（3）mB=kA/kB·mA+（bA-bB）·kB,这种函数关系仅在给定的条件下成立。当B物质测定时，测定的检测信号值（SB），通过A的标准曲线方程（1）求出相应的质量值（mA），然后再通过方程（3）求得B的质量（mB）。当方程（3）的bA和bB均为0时，则符合目前替代标准品校正因子的原理，因此，校正函数法弥补了现有替代标准品分析中校正因子适用性的不足，拓宽了适用范围。
   
    螺菌黄质系Car合成途径广泛分布于APB各种群中，关于该系Car组分的定性和表观定量分析已有较多报道，但尚未见到螺菌黄质系Car多组分绝对定量分析的系统报道。在前期研究中，本课题组以光合色素定性的菌株为对照，实现了光合色素的快速定性分析。在此基础上，本文依据替代标准品的思想，选择番茄红素和柠檬黄作为替代标准品，以光合色素定性的APB菌株作为色素定性对照，以自制的Car作为标准品，确立了待测Car组分与替代标准品之间的定量校正函数关系，能够更准确地传递待测组分的量值关系，弥补了现有替代标准品分析中校正因子适用性的不足，使适用范围更宽。通过替代标准品的校正函数关系，建立2种Car多组分准确定量的方法，实现了螺菌黄质系合成途径中6种Car的快速、准确的定性定量分析，增添了替代标准品分析的新认识，使替代标准品分析法更具普适性。这为全面实现APB不同途径Car的快速、准确定量分析提供了借鉴和参考，也对光合色素代谢与调控研究水平的提高以及APB产品质量评价指标体系的提升等均具有重要意义。
   
    材料和方法材料菌株：沼泽红假单胞菌（Rhodopesudomonnaspalustris）CQV97和海洋着色菌（Marichromatiumgracile）YL28,GenBank登录号分别为EU882154和JF719917,本实验室分离、鉴定并保存。
   
    主要仪器、材料和试剂：CTO-20A高效液相色谱仪（SPD-M20ADADDetector,Shimadzu）。UV-3200PCS紫外可见分光光度计（MAPADA）。硅胶层析G板（30mm×100mm）和200目层析硅胶（青岛海洋化工厂）。柠檬黄标品（Tartrazine,简称Tar,上海染料研究所）。甲醇、乙腈及乙酸乙酯为色谱纯，其它试剂为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
   
    Car样品的制备和回收率测定
   
    按文献方法进行细菌培养和菌体收集。色素提取液的制备采用改良的丙酮甲醇法：菌体细胞依次用甲醇和丙酮甲醇（7∶2,V/V）和丙酮各提取1次，合并提取液并定容，40℃减压旋转蒸发浓缩，即得色素提取液。色素提取液体积是通过测其浓缩前后BChla的光密度（OD770）来确定。Car样品的制备采用硅胶柱层析法：硅胶经石油醚浸泡装柱（玻璃层析柱规格为15mm×200mm），柱床体积为219ChunguiZhaoetal./ActaMicrobiologicaSinica（2014）54（2）20mL,石油醚平衡层析柱，取2.00mL色素提取液上样，流动相为石油醚：丙酮（9∶2.5,V/V），收集第一个洗脱组分（19-39mL），减压旋转蒸发浓缩，通过测定样品浓缩前后Car的OD475,计算样品浓缩后的体积，确定菌体质量和样品体积的关系，即得Car样品。浓缩后样品体积的计算依据公式V2=V1·OD1/OD2,其中V1和V2分别为浓缩前和浓缩后的体积，OD1和OD2分别为浓缩前和浓缩后测定的光密度值。取CQV97湿菌体0.207g,经过色素提取和浓缩，得到2.4473mL色素提取液，从中取2.00mL进行硅胶柱层析，洗脱组分经浓缩得到2.0992mLCar样品，其中含有0.0169g菌体的Car,即可到0.0806g/mL菌体的Car样品。Car提取回收率的测定是将制备的Car样品重复3次硅胶柱层析。Car样品黑暗4℃暂时储存，HPLC分析前，经10000×g离心10min,取上清液。
   
    柠檬黄溶液的配制和稳定性测试
   
    精确称取0.0112g柠檬黄标品，超纯水溶解，定容至10mL,0.45μm滤膜过滤，其浓度由426nm处光密度（OD426）确定，摩尔消光系数（εmax）为18200L/（mol·cm），经标定柠檬黄标准液的浓度为1.1043mg/mL,4℃冰箱黑暗保存备用。将柠檬黄稀释至20.0mg/L,置于常温黑暗条件下，于0、24、48、72和96h取样，测定其吸收光谱，观察柠檬黄溶液的暂时储存稳定性。
   
    Car标准品的制备、纯度鉴定和定量
   
    将1.2制备的色素提取液，采用TLC方法制备6种Car标准品溶液。展层剂配方为石油醚∶正己烷∶异丙醇∶丙酮∶甲醇（8∶0.75∶0.2∶0.8∶0.2）。分别刮取TLC层析板上各Car条带溶于丙酮，10000×g离心10min取上清进行HPLC纯度分析，得到6种纯Car溶液。若某种Car纯度不够，则再经TLC纯化。依据文献报道的λmax和εmax,分别对纯化Car进行定量，得到6种Car标准溶液（编号H1-H6），于4℃冰箱中黑暗保存备用。
   
    HPLC分析条件的确定和Car定性的HPLC指纹图谱测定柠檬黄溶液和6种Car的吸收光谱，依据其吸收光谱确定475nm为HPLC检测波长。HPLC分析采用反向C18柱（Shim-packVP-ODS,150mm×4.6mmI.D,Shimadzu），DAD检测器，柱温30℃，进样量20μL,流动相A为90%乙腈水（V/V），流动相B为乙酸乙酯。经反复摸索，确定了能将Car组分良好分辨的HPLC梯度洗脱程序：0-5min,0%-45%B;5-25min45%-70%B,流速为0.7mL/min.以纯化的6种Car标准品为对照，获得了CQV97菌株Car的标准HPLC指纹图谱。待测样品中的多组分Car的定性分析是以CQV97菌株的Car为对照进行。除特殊说明外，本文样品的测定均采用该HPLC设定参数和条件。
   
    样品测定的精密度和时间稳定性
   
    依据1.5的HPLC分析条件进行样品精密度测定：取40.3mg/mL菌体的Car样品和10.0mg/L柠檬黄样品20μL进样，以保留时间和峰面积为检测指标，连续重复测定6次；时间稳定性和短时光照稳定性测定是将4℃黑暗保存的样品，分别于0、4、8、16、20和24h取样，每次取样前，样品以日光灯光源300lux光照2min.
   
    标准曲线制作和检出限
   
    将6种Car和Tar标准液浓度（mg/L）分别稀释至2.60、10.70、61.17、3.80、5.27、9.13和80.00,取3-20μL上样。依据1.5的HPLC分析条件重复3次测定，取其均值，以峰面积对质量作图，绘制6种Car和柠檬黄的标准曲线，并进行线性拟合。依据信噪比（S/N）等于3的值确定待测样品的检出限。Car组分与替代标准品的定量关系在选择的检测波长和检测条件下，以柠檬黄和番茄红素分别为替代标准品，通过待测组分标准曲线和替代标准品的标准曲线，建立替代标准品与待测标准品之间的函数关系，当待测组分与替代标准品峰面积相等时，待测组分与替代标准品的质量之间呈特定的关系。采用消元法解联立方程，导出各待测组分与替代标准柠檬黄和番茄红素含量之间的校正函数关系。
   
    样品的加标回收率
   
    将Car样品配制成含0.0403g/mL菌体的色素溶液，同时配制Car的加标样品，在选择的参数和条件下进行HPLC测定，重复6次，依据Car的标准曲线计算样品中各Car组分的含量，按公式：加标回收率（%）=（ρ2-ρ1）/ρ0×100计算6种Car的加标回收率，其中ρ0、ρ1和ρ2分别为加入标准的浓度、样品的浓度和加标样品的浓度。
   
    各取菌体细胞0.207g和0.193g,分别制备成0.0806g/mL和0.0724g/mL菌体的Car样品。在选择的HPLC分析条件下，以CQV97Car样品作为定性对照，取20μL待测样品上样，样品稀释倍数为2,重复测定6次。分别用柠檬黄替代标准品（Std1）法和番茄红素替代标准品（Std2）法计算样品中Car成分的含量，与待测Car标准品（Std0）法进行比较。结果和分析Car样品的制备和回收率测定采用硅胶柱层析制备的Car样品，其吸收光谱呈现Car典型的三指峰，特征吸收峰为407、475和507nm,未见明显的细菌叶绿素吸收峰。重复测定3次，Car组分的回收率为94.84%,其RSD为1.49%,表明硅胶柱层析能将Car组分稳定高效回收，制备的Car样品能够满足Car组分含量测定的要求。
   
    柠檬黄溶液的稳定性
   
    柠檬黄溶液的吸收光谱如图1-A所示。柠檬黄在256nm和426nm呈现特征吸收峰，室温黑暗条件下放置96h内，期间5次取样测定，柠檬黄溶液350-500nm吸收光谱重叠在一起，未发生明显变化。结果表明：在常温黑暗条件下，在350-500nm进行光谱测定，柠檬黄能够满足其作为替代标准品测定的要求。
   
    Car标准品的制备、纯度鉴定和定量分析
   
    CQV97菌体细胞色素TLC指纹图谱和制备的6种Car的HPLC分析如图2所示，TLC制备的6种Car的编号、名称和Rf值，以及HPLC保留时间（Rt）和纯度见表1.结果表明：制备的Car组分纯度较高，均达95%以上，且彼此出峰时间不重叠，能够满足Car标准品的要求。利用各Car的最大吸收波长λmax和摩尔消光系数εmax（表1），测定6种Car在相应溶剂中的含量，即得Car标准溶液，其浓度（ρ）见表1.
   
    HPLC分析参数和Car标准
   
    HPLC图谱柠檬黄和6种Car的吸收光谱见图1-A和图1-B,它们的最大吸收峰（λmax）有较大差异，HPLC分析可以选定每种色素的λmax作为检测波长，测定的灵敏度高，DAD检测器虽然容易实现，但由于Car组分较多，若选择多个检测波长，在非DAD检测器的HPLC分析中，工作量较大且繁琐。虽然柠檬黄和6种Carλmax有较大差异，但它们在475nm均有较强的光吸收，而且文献中也常用475nm进行HPLC分析，为了测定简便，将HPLC分析的波长选定为475nm.在选择的条件下，HPLC能够良好分辨CQV97样品的6种Car.因此，采用该HPLC条件进行螺菌黄质系Car的定性定量分析。以制备的6种Car纯品为对照，得到了螺菌黄质系Car的HPLC定性指纹图谱，数据见表2.
   
    样品测定的重复性和时间稳定性
   
    柠檬黄HPLC分析图谱呈现单一色谱峰，柠檬黄和Car样品的重复性和24h内样品的稳定性如表2所示。HPLC重复测定各组分的保留时间（Rt）和峰面积（S）的RSD（%）均不大于2.1,24h内6次取样分析，其RSD均不大于2.5%.结果表明：在24h内重复测定，即使是短时间光照，光强低于300lux,柠檬黄标准液和制备的Car样品稳定性较好。
   
    标准曲线制作和检出限HPLC分析的标准曲线见图3,各标准品标准曲线的拟合方程、检出限及线性范围见表3,其中m和S分别表示各标准品进样体积中的质量和峰面积。采用线性拟合，各标准曲线均良好地符合线性方程y=ax+b（R2>0.999），若采用正比函数关系拟合，仅有柠檬黄的标准曲线能够良好地符合方程y=ax（R2>0.999），而6种Car标准曲线拟合方程的R2相对较低，尤其是H4、H5和H6,拟合方程的R2约为0.9.由此可见，检测组分的含222赵春贵等：替代标准品校正函数法定量分析不产氧光合细菌螺菌黄质系类胡萝卜素。/微生物学报（2014）54（2）量与检测的峰面积之间呈良好的线性关系，但不是近似过原点的直线，不符合替代标准品法计算校正因子的原理，因此需要深入地分析思考它们之间的定量关系。
   
    替代标准品和待测组分的校正关系在特定的检测波长和检测条件下，当检测信号（峰面积）相等时，替代标准品的质量分别与6种待测Car质量之间呈特定的函数关系。以mTar和mLyc和mi分别表示替代标准品柠檬黄（Std1）、替代标准品番茄红素（Std2）和待测Car的质量，替代标准品的标准曲线和待测Car标准品的标准曲线通过消元法解联立方程，分别确定了替代标准品质量与各待测Car的质量之间的校正关系，如表4所示。样品测定时，以替代标准品制作标准曲线，通过替代标准品的标准曲线求得各待测Car组分相对于替代标准品的量值（mTar或mLyc），再通过相应的校正关系求出各待测组分的量（mi）。
   
    样品的加标回收率Car标准品法测定的Car样品各组分的加标回收率如表5所示，CQV97菌体样品中积累的6种Car的加标回收率在96%-104%之间，采用2种替代标准品法计算的加标回收率与Car标准品法测定的结果相一致，误差小于0.1%.表明样品中影响Car测定的干扰因素较小。各Car组分含量分析如表6和表7所示，Car标准品法（Std0）测定：CQV97积累的Car各组分含量（μg/g）在61.75-281.71之间，其中Rhodopin含量最高，占Car总量的44.35%;YL28主要积累Rhodopin,占Car总量的70.26%;供试样品中各Car组分含量测定的RSD不大于1.5.2种替代标准品（Std1和Std2）法测定的供试样品中Car各组分含量、相对含量和RSD与Car标准品（Std0）法测定的结果良好地吻合，其相对标准误差小于0.1%.结果表明：柠檬黄或番茄红素作为Car组分的替代标准品准确可靠，能准确地传递待测Car组分之间的量值关系。Car标准品法与替代标准品法计算的CQV97菌体中积累Car组分的相对含量与相对峰面积法计算的结果相比有较大差异。究其原因，峰面积并不是含量，虽然峰面积与含量成正相关关系，但各组分峰面积与含量之间的关系系数不尽相同，是造成测定结果差异的重要原因。
   
    讨论
   
    样品的稳定性是实现高准确度定量分析的关键。APB菌体中同时含有Car和BChl两类色素，由于样品中含BChl,多次测定Car组分的偏差较大，其原因是HPLC进样等过程中很难完全避光，样品中的BChl见光可产生单线态氧（1O2），导致样品中Car易光解。因此，我们采用硅胶层析法去除了样品中的BChl,样品Car回收率高且稳定。制备的Car样品即使给予300lux短时间光照，24h内HPLC重复测定稳定性好，样品的稳定性能够满足HPLC分析要求。
   
    替代标准品法定量分析，首先要求对测定组分进行定性分析。HPLC、UV-Vis和MS数据综合分析，是目前APBCar定性的主流方法，但该方法对操作者要求高，而且质谱仪昂贵，检测成本较高。与文献中报道的HPLC指纹图谱比较也是Car定性分析的可行方法，但由于图谱中保留时间相近色谱峰的缺失以及不同批次操作之间的差异，若没有标准对照，有时则难以鉴别，例如：YL28色素的HPLC图谱中缺失H2和H4色谱峰，H3很难辨认，若同时与CQV97Car色谱图比较，则容易鉴别。鉴于CQV97稳定地积累螺菌黄质系6种Car,而且各组分的色谱峰清晰可辨，因此我们建议，在样品定性和定量分析时，应同时以CQV97的Car作对照。替代标准品的优势和校正因子法的局限性。替代标准品法也称“一测多评法”,是解决对照品紧缺、多组分同步测定和降低检测成本的良好策略。
   
    通过替代标准品与多个测定组分量值之间的校正因子（RCF），实现了待测样品中多测定组分的同步测定。但我们在测定过程中，与相应的标准曲线相比，采用RCF校正的误差较大，待测Car组分不同，误差不同，其中H4的相对误差最大。经过仔细分析，除了替代标准品柠檬黄的标准曲线近似地经过原点，待测组分的标准曲线是不经过原点的直线，尤其是H4,若强制过原点，其标准曲线拟合的R2甚至小于0.9.由此可见：替代标准品校正因子法，仅适合于标准曲线过原点或近似过原点的情况，而对于不过原点的标准曲线之间，则不能简单地套用替代标准品的方法确定替代标准品与待测样品之间的校正关系。鉴于这种情况，我们尝试了替代标准品校正函数法进行了Car组分的定量分析，其原理是：
   
    在给定条件下，各个待测组分的含量与检测器响应信号呈线性关系，那么各待测组分之间的响应信号和含量之间也应该具有固有的相关关系，换句话说，当检测信号的值相等时，待测组分含量（浓度或质量）的值之间呈现特定的函数关系，当待测组分的含量相等时，它们之间的检测信号值呈现特定的函数关系。依据这一原理，我们以替代标准品与待测组分的标准曲线为基础，以响应信号（峰面积）为媒介，尝试消元法解联立方程，假定响应信号相等，建立了待测组分和替代标准品之间量值的校正函数关系，通过函数关系校正替代标准品与待测组分的量值关系。鉴于此，在本文确定的HPLC测定条件下，我们分别以柠檬黄和番茄红素为替代标准品，依据其标准曲线，逐一建立了替代标准品与6种Car之间的量值校正关系曲线。通过替代标准品校正关系测定的各Car组分的含量、相对含量、RSD和回收率均与标准曲线法测定的结果良好地吻合，其相对标准误差小于0.1%,其误差来源主要是由于校正函数关系的有效数字取舍产生的。表明替代标准品柠檬黄和番茄红素校正函数法准确度高，能准确地传递待测组分之间的量值关系。为了与RCF相区别，我们将之称为校正函数法，由于直线方程包括经过原点的直线方程，校正函数法原则上适合于任何相关关系的校正，也适用于目前的替代标准品校正因子，弥补了现有RCF的不足。
   
    综上所述：采用HPLC方法，分别以柠檬黄和番茄红素为替代标准品，分别建立了这2种替代标准品与6种Car组分的定量校正函数关系，以CQV97的Car组分做定性对照，实现了光合细菌螺菌黄质系Car组分的定性定量分析。与待测物标准曲线法相比，替代标准品校正函数法同样具有准确度高、重复性好、稳定性好的优点。与多组分标准品法相比，替代标准品法更加简单、快速、成本低廉。本文建立的方法为APB光合色素代谢的定量分析提供了思路和方法的保障。现有替代标准品RCF校正法，仅适合于标准曲线过原点或近似过原点的情况，若标准曲线不过原点，则误差较大，不具有普适性。而校正函数法基于测定的标准曲线，通过理论推导建立了替代标准品与待测组分之间量的校正函数关系，弥补了现有RCF的不足，使替代标准品与待测组分之间的量值的传递更加能准确，误差更小，进一步完善了替代标准品法的思想，提高了替代标准品法的普适性。