对川楝内生真菌进行形态学鉴定

　　川楝 Melia toosendan Sieb. et Zucc. 是楝科（Meliacease）楝属Melia Linn. 的落叶乔木，主要分布于四川、贵州、云南，主要有效成分为川楝素（toosendanin，C3OH38O11），有驱虫、抗癌、抗毒素等作用。川楝虽然分布广泛，但川楝素的产量却较低，而药用植物内生菌可以产生与宿主相同或相似的天然活性物质，如苦楝素、鬼臼毒素类似物。

　　聚酮类化合物（polyketide，PK）与非核糖多肽（nonribosonmal peptide，NRP）是 2 类具有代表性的天然产物，可用作抗生素、抗真菌剂、抗癌药物、免疫制剂、抗病毒药物等。催化这些天然产物合成途径的酶称为聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS ）和非核糖体多肽合成酶（ nonribosonmalpeptidesynthetase，NRPS）。已有研究发现，禾本科植物内生真菌中存在 NRPS，番荔枝 Annonasquamosa L. 内生真菌中存在 PKS。但是目前对药用植物内生真菌 PKS 和 NRPS 的研究相对较少。

　　传统真菌的鉴定以形态、生化等表型特征为基础，过程复杂，同时不产孢菌株用此方法鉴定较为困难。而分子生物学的发展为真菌的鉴定提供了更全面、科学的依据。ITS 序列在核苷酸序列上的高度变异性和长度上的保守型，可以获得足够的信息来反映真菌种水平间的差异，目前已应用于药用植物内生真菌的鉴定。

　　本研究对川楝内生真菌进行了形态学鉴定，通过 PCR 扩增其 ITS 序列、PKS 和 NRPS 基因，进行BLAST 比较和系统发育分析，以期了解川楝内生真菌的遗传多样性，为川楝内生真菌资源的开发利用提供依据，同时丰富 PKS 和 NRPS 基因数据库。

　　1、 材料

　　采集四川省雅安市、攀枝花市、宜宾市、广元市、成都市、乐山市、西昌市、绵阳市、达州市 9个地点，经四川农业大学胡超讲师鉴定为川楝 Meliatoosendan Sieb. et Zucc. 的根、茎、叶、皮、果，从中共分离得到了 126 株内生真菌，经去重和限制性片段长度多态性（ restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP）分析后选取 39 株多样性明显的菌株作为本研究的目标菌株。

　　2、 方法

　　2.1 内生真菌表型鉴定

　　用 PDA 培养基对 39 株菌株进行插片培养，观察菌落特征和显微形态特征，参照魏景超=的方法将其鉴定到属。

　　2.2 内生真菌总 DNA 的提取

　　采用改良的 CTAB 法提取川楝内生真菌的DNA，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量和大小，置于?20 ℃保存备用。

　　2.3 ITS-PCR 扩增

　　ITS-PCR 扩增所用引物为 ITS1（5’-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3’）由上海生工合成。ITS-PCR 扩增的反应体系（30 μL）：2×PCRMix 15 μL，ITS1（10 pmol）1 μL，ITS4（10 pmol）1 μL，DNA 1 μL，无菌重蒸水补足至 30 μL。反应程序：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，35 个循环，72 ℃延伸 10 min，产物于 4 ℃恒温保存。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。

　　2.4 PKS 基因的扩增

　　PKS 基因扩增所用引物为 KAF（5’-GARKSICAYGGIACIGGIAC-3’）、KAR1（5’-C-CAYTGIGCICCRTGICCIGARAA-3’ ） 和 KAR2（5’-CCAYTGIGCICCYTGICCIGTRAA-3’）由上海生工合成。PKS 扩增的反应体系（30 μL）：2×PCR Mix 15μL，KAF（10 pmol）1 μL，KAR1 或 KAR2（10 pmol）1 μL，DNA 2 μL，无菌重蒸水补足至 30 μL。反应程序：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 1 min，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，35 个循环，72 ℃延伸 10 min，产物于 4 ℃恒温保存。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。

　　2.5 NRPS 基因的扩增

　　NRPS 基因扩增所用引物为 AUG003（ 5’-CCGGCACCACCGGNAARCCHAA-3’ ） 和AUG007（5’-CCGGACCATGTCGCCNGTBYKRT-A-3’）由上海生工合成。NRPS 扩增的反应体系（30 μL）：2×PCR Mix 15μL，AUG003（10 pmol）1 μL，AUG007（10 pmol）1 μL，DNA 2 μL，无菌重蒸水补足至 30 μL。反应程序：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min，产物于 4 ℃恒温保存。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。

　　2.6 测序及序列分析

　　将 ITS 的产物和得到的 PKS、NRPS 基因片段直接送华大基因科技有限公司测序。将所得序列在 GenBank 中进行BLAST同源性检索，将获得的同源序列和测定序列用 Clustal X 进行分析，采用 MEGA5.0 软件包中的 Kimura-2-Parameter Distance 模型进行多序列匹配，用邻接法（Neighbor-joining, NJ）构建系统发育树，Bootstrap 1 000 次检测各分支的置信值。将所测的序列提交到 GenBank 数据库，获得登录号。

　　3、 结果与分析

　　3.1 川楝内生真菌的鉴定

　　

　　本实验共分离得到 126 株内生真菌，经初步去重和限制性片段多态性分析后选择 39 株为代表菌株进行进一步分析，见表 1。经过表型鉴定（部分菌株的表型见图 1），能够鉴定到属的内生真菌菌株为 31 株，分属于 17 个属。部分菌株由于未产孢而没有鉴定到属。它们分别为青霉属 Penicillium Lk.ex Frise、木霉属 Trichoderma Pers. ex FR.、曲霉属Aspergillus Micheli ex Fr.、交链孢属 Alternaria Neesex Wallr.、黑葱花霉属 Periconia Tode ex Schw.、附球菌属 Epicoccum Lk. ex Wallr.、镰孢霉属 FusariumLk. ex Fr.、枝顶孢霉属 Acremonium Lk. ex Fr.、多节孢属 Nodulisporium Press、肉座菌属 Hypocrea Fr.、毛壳菌属 Chaetomium Kunze et Schmidt、脉纹孢菌属 Neurospora Shear et Dodge 、 拟 茎 点 霉 属Phomopsis Sacc.、芽枝霉属 Cladosporium Link exFr.、节孢霉属 Arthrinium Kunze、茎点菌属 PhomaSacc. 和短梗蠕孢霉属 Trichocladium Harz。

　　3.2 川楝内生真菌的系统发育分析

　　川楝内生真菌菌株 DNA 用引物 ITS1 和ITS4 扩增得到的 PCR 产物，大小在 500～600 bp（图 2）。

　

　　通过用 BLAST 在 Genbank 数据库序列对比分析发现，川楝内生真菌种群结构具有非常丰富的资源多样性。在本研究中，序列相似性最低的为 SCAU-F-210 ， 与 相 似 性 最 高 的 Periconiamacrospinosa 相 似 性 仅 为 86% ； 产 孢（SCAU-F-182）与 Botryotinia fuckeliana 相似性最高，为 100%。

　　系统发育树（图 3）显示，川楝内生真菌分属于短梗蠕孢霉属、微壳色单隔孢属 MicrodiplodiaAll.、青霉属、交链孢属、脉纹孢菌属、附球霉属、新丛赤壳科属 Neonectria Wollenw.、曲霉属、芽枝霉属、拟茎点霉属、木霉属、茎点霉属、Neofusicoccumparvum Crous、黑葱花霉属、镰孢霉属、毛霉属 MucorMicheli ex Fries、节孢霉属、毛壳菌属、皱赤壳属Rugonectria P. Chaverri et Samuels、多节孢属、肉座菌属、鹿角菌属 Xylaria Hill ex Grev.、葡萄孢盘菌属 Botryotinia Whetzel、枝顶孢霉属和炭垫属Nemania S. F. Gray 25 个属。所得 39 个序列中有 7个序列归属于曲霉属（17.9%），6 个归属于青霉属（15.4%），为川楝内生真菌的优势属。

　　3.3 PKS 基因的分析

　　部分菌株的 PKS 基因扩增电泳图见图 4，由图可见产物条带在 600 bp 左右。

　

　　共得到 12 个 PKS 基因片段，占总量的 30.8%。将测序得到的 PKS 基因片段用 BLAST 比对，结果见表 2。本研究得到的 PKS 片段与 GenBank 中已知 PKS 序列的相似度较高，从 99%～100%。本研究中得到的 PKS 基因均为 I 型的 PKS。PKS 基因的系统发育树（图 5）显示，它们分属于曲霉属、交链孢属、镰孢霉属、葡孢盘菌属，其中有 7 个为曲霉属。

　

　　3.4 NRPS 基因的分析

　　菌株的 NRPS 基因扩增电泳图见图 6，由图可见产物条带在 700 bp 左右。本研究共得到了 6 个NRPS 基因片段，占总量的 15.4%。将测序得到的NRPS 基因片段用 BLAST 比对，结果见表 3。本研究得到的 NRPS 片段与 GenBank 中已知 NRPS 序列的相似度很高，从 99%～100%。得到的 6 个 NRPS 基因的相似序列都为Penicillium sp.，因此 NRPS 的系统发育树省略。

　

　　4、 讨论

　　研究发现，药用植物具有非常丰富的内生真菌资源。而楝科植物内生真菌的研究主要集中在苦楝M. azedarach L. 和印楝 Azadirachta indica A. Juss上，本研究弥补了对川楝内生真菌研究的不足。

　　Geris 等从巴西苦楝分离出 55 株内生真菌，分属于 8 个属，青霉属和曲霉属是最多的。陈远友等从安徽农大校园等地苦楝分离出了 290 株，分属于11 个属，其中匐柄霉属 Stemphylium Wallr.、交链孢属、刺盘孢属 Colletotrichum Corda 和拟茎点霉属是优势属。邵士成等从云南印楝分离出 372 株，分属于 50 个属，分布广泛的是刺盘孢属、交链孢属、鹿角菌属。Verma 等从印度印楝中分离出了 233株，分属于 18 个属，拟茎点霉属、枝孢霉属、拟盘多毛孢属 Pestalotiopsis Steys. 为优势属。本研究对川楝内生真菌的形态学鉴定和系统发育分析表明，川楝内生真菌分属于 25 个属，青霉属、曲霉属为优势属，可能植物种类和地理位置对内生真菌的资源多样性、优势种群有很大的影响。其他研究人员对川楝和印楝内生真菌的研究大多采取形态学鉴定的方法，而本研究采取形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合的方法，弥补了不产孢菌株鉴定的不足，使川楝内生真菌的资源多样性较为完整，同时也证明了 ITS 结果的可靠性。但是，由于数据库还不够完善，有的菌株并没有鉴定到种。川楝内生真菌在资源的多样性上为寻找产生生物活性物质的菌株奠定了基础。

　　研究人员已经从印楝和苦楝的内生真菌中发现了多种生物活性物质。Geris 等从苦楝内生真菌青霉属分离得到了有抑菌活性的 3 个化合物。Campos 等从苦楝内生真菌 Aspergillus aculeatusIizuka 中首次分离到 2 个聚酮类化合物。Yang 等从苦楝内生真菌 Fusarium sp. LN-10 发酵产物中分离得到了有较强的海虾致死活性的化合物。本研究从川楝内生真菌中筛选出了 12 株含 PKS 基因的菌株和 6 株含 NRPS 基因的菌株，这些菌株隶属于青霉属、曲霉属、葡孢盘菌属、交链孢属、镰孢霉属。

　　本研究从 6 株青霉属菌株中筛选出了 NRPS 基因，7株曲霉属菌株中筛选出了 PKS 基因，表明川楝的内生真菌还是有发掘潜力的，其中青霉属和曲霉属值得深入研究。

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