探讨玉米品种对根际微生物活性和群落组成的影响

　　引言

　　根际是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面。

　　根据碳同位素示踪研究，禾谷类作物一生中，近30%~60%光合产物转移至地下，其中 40%~90%以无机和有机分泌物形式释放到根际。这些根系分泌物为微生物提供了丰富的营养和能量物质，根际微生物是受植物影响最大的土壤微生物群体。国内外学者对影响根际微生物方面的因素做了大量的研究，如肥料施用、植物和土壤类型、CO2浓度、转基因作物等对根际微生物活性和群落组成的影响。迄今为止，不同基因型作物品种对根际微生物活性及群落组成的作用研究甚少，因此本研究选取中国广为种植的4个玉米品种，旨在探讨玉米品种对根际微生物活性和群落组成的影响。

　　1 材料与方法

　　试验地点：中国科学院南京土壤研究所温室、微生物研究室、封丘农业生态试验站；试验时间：2012年7—9 月。

　　1.1 盆栽试验
　　温室盆栽试验选取玉米品种‘郑单958’、‘中单909’‘、陕单 8806’‘、农华 101’。盆栽土壤是典型的砂质壤土，发育于黄河冲积沉淀物，其质地为456 g/kg砂粒、407 g/kg 粉粒、137 g/kg 黏粒。4.67 g 尿素（含46.3% N）、2.21 g 过磷酸钙（含 46.1% P2O5）、1.43 g硫酸钾（含49.6% K2O），连同 13 g 风干土（质量含水量1.47%）一并均匀混合后填装于直径 25 cm、高 26 cm 塑料桶（氮磷钾和土壤按1:1:1:6的重量比混合）。种子在培养箱中催芽1周后（温度25℃、湿度80%），选取长势良好的幼苗移栽到每个桶里（土壤已被浇透过夜）。

　　每桶栽一颗作物，每个品种设置4个重复。玉米生长期间，土壤被统一足量地浇水。

　　13C 标记在玉米拔节期进行，所有植株用透明塑料膜(300 cm × 220 cm × 170 cm)密闭地包裹并通入50 mL13CO2（13C 原子丰度 98%以上），在日光下维持10 h 光合作用（为保持空气流通，塑料膜内安置一小电扇），晚上揭开塑料膜。13C 标记以此重复 6 天。

　　玉米植株于开花期收获，于60℃烘干并称重。根部周围的土壤被轻轻的抖掉，用镊子小心地收集剩余粘附于根表面的根际土壤。一部分根际土样于4℃保存用于测定某些微生物性质指标，另一部分于-20℃保存用于微生物分子分析。

　　1.2 样品分析
　　土壤β-葡糖苷酶活性和球囊霉素蛋白含量分别用Tabatabai 的方法和Wright and Upadhyaya的方法测定。微生物生物量碳用Potthoff等的方法提取，其浓度和13C 丰度用元素分析仪偶联同位素比值质谱仪（Delta V，Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）测定。

　　磷脂脂肪酸(PLFA)用改良的Bligh and Dyer方法提取，其甲基化产物脂肪酸甲酯用Agilent 6850气相色谱测定（火焰离子检测器，色谱柱型号为 Agilent19091B- 102E Ultra 25% Phenyl Methyl Siloxane，25.0 m×200 μm×0.33μm）。磷脂脂肪酸按 Petersen andKlug 的方法命名。

　　根 际 土 壤 DNA 用 FastDNA SPIN (MPBiomedicals，Santa Ana，CA，USA)试剂盒提取，丛枝菌根真菌聚合酶链式反应（PCR）扩增程序见表1。PCR产物经变性梯度凝胶电泳（DGGE）后用 MolecularImage FX (Bio-Rad，Hercules，CA，USA)拍照。DGGE条带序列重新 PCR 扩增后用 PEASY-T3 (TransGen，Beijing)试剂盒克隆。测序工作由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成，序列用 BLAST 程序比对并从GenBank 数据库中找出与其最相似的属种序列。【表1】

　　1.3 统计分析
　　本研究对测量指标在玉米品种之间的差异显着性作方差分析，并对其作泊松相关性检测。所有结果在烘干重基础上（土壤在 105℃烘 12 h，植株在 60℃烘48 h）以 4 个重复的平均值表达。统计分析用 SPSS16.0 软件完成。

　　2 结果与分析

　　2.1 玉米品种对作物生物量和根际微生物性质的影响
　　玉米作物总生物量、根部和冠部生物量、β-葡糖苷酶活性、易提取态球囊霉素蛋白含量、总球囊霉素蛋白含量均按以下顺利显着地（表2，P＜0.05）增加：‘郑单958’＜‘陕单 8806’＜‘中单 909’＜‘农华 101’。‘中单909’和‘农华 101’根际微生物生物量碳含量和13C 丰度明显地（表2，P＜0.05）高于‘郑单958’和‘陕单8806’。【表2】

　　‘郑单958’和‘陕单8806’根际土壤磷脂脂肪酸含量明显地低于‘中单909’和‘农华101’，大多数磷脂脂肪酸成分在‘农华101’根际土壤中含量最高；脂肪酸i14:0、15:00、16:12OH在‘郑单958’和‘陕单8806’根际土壤未被检出，脂肪酸17:1ω8c、17:00、16:02OH只出现在‘农华101’根际土壤，脂肪酸18:03OH只出现在‘中单909’根际土壤（表3）。以磷脂脂肪酸表征的根际革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌生物量均按‘郑单958’、‘陕单8806’‘、中单909’‘、农华101’顺序地增加，并且它们在‘中单909’和‘农华101’根际土壤的含量均显着地(P＜0.05)高于‘郑单958’和‘陕单8806’（图1）。【图1.表3略】

　　
　　相关分析显示玉米总生物量、冠部生物量和β-葡糖苷酶活性、易提取态球囊霉素蛋白含量、总球囊霉素蛋白含量、革兰氏阳性细菌生物量之间均有极显着的(P＜0.01)相关性，和微生物生物量13C 丰度、革兰氏阴性细菌生物量、真菌生物量之间也有很好的(P＜0.05)相关关系，而根冠比与被测微生物性质指标之间均无显着相关性（表4）。【表4】

　　2.2 玉米品种对根际丛枝菌根真菌群落的影响
　　玉米品种根际丛枝菌根真菌部分序列的DGGE图谱显示出10个主条带，条带测序结果表明球囊霉菌属(Glomus)在4个玉米品种根际中占有重要地位（图2，表 5）。每个玉米品种的根际丛枝菌根真菌序列片段的DGGE图谱中，至少有一个电泳条带与其他3个品种存在差异，说明这4个玉米品种有着不一样的根际丛枝菌根真菌群落结构（图2，表5）。【图2略.表5】

　　3 结论

　　β-葡糖苷酶是土壤中最丰富，极易被鉴定的酶，并且与土壤中有机成分的降解有关。球囊霉素相关蛋白与土壤结构和肥力提升有很大关系。微生物生物量13C 丰度的大小代表了微生物同化根系分泌物能力的强弱。这3个微生物性质指标基本可以表征微生物的活性。本研究选取的4个玉米品种在形态特征上差异明显‘，中单909’和‘农华101’比‘郑单958’和‘陕单8806’的生物量更大，根系更发达。作物生物量，尤其是冠部生物量，与根际微生物活性和生物量正相关联。PLFA分析表明4个品种的根际微生物群落组成存在差异，DGGE图谱也显示它们的根际菌根丛枝真菌群落结构不同。从研究结果中推断：品种形态学之间的差异可能会导致根际微生物性质和群落组成的分异。

　　4 讨论

　　根际微生物活性与生物量直接受根系分泌物影响。

　　生物量更大的玉米植株，其根系分泌能力可能更强，产生更多种类和数量的根系分泌物，提供根际微生物更多的营养和能量来源。作物的部分光合产物转移至地下部，以根系无机和有机分泌物的形式被根际微生物同化吸收。本研究表明‘中单909’和‘农华101’根际微生物生物量13C 丰度比‘郑单 958’和‘陕单 8806’更高，说明它们同化吸收了更多的根系分泌物，这也间接证实了它们高的活性和生物量受根系分泌的影响。在植物-根际微生物-土壤体系中，根际微生物对根系分泌物、土壤类型、根形态特性的响应塑造了根际微生物的群落结构。4个玉米品种盆栽试验的土壤完全相同，由于品种之间不同的根形态特性、不同的根系分泌能力导致品种之间的根际微生物群落差异。Bouffaud等的研究表明玉米根际细菌群落组成明显依赖于玉米品种基因型，且主要表现于某些β变形菌属和特定的伯克氏菌属上的改变。

　　丛枝菌根真菌普遍存在于陆地生态系统中，能与部分根际细菌一起协同促进作物生长，能通过菌丝分泌球囊霉素蛋白并促进土壤团聚体的形成，从而改良土壤结构。DGGE图谱显示4个玉米品种的根际丛枝菌根真菌群落组成比较单调，只有10个主条带出现。玉米盆栽的磷肥施用量是很大的，达到167 g/kg，可能会影响到根际丛枝菌根真菌的群落组成。Wang等的研究表明土壤速效磷是限制丛枝菌根真菌生长的一个关键因子。DGGE图谱只能显示300 bp左右的基因扩增序列片段，不能完全反映丛枝菌根真菌的群落信息。尽管如此，本研究结果显示球囊霉菌属（Glomus）是根际丛枝菌根真菌群落的重要组分，这与前人的研究相一致。

　　本研究使用比较传统的PLFA和PCR-DGGE方法探讨微生物的群落组成，不同得到详细的微生物分类和发育信息，运用先进的分子技术探讨品种根际的微生物群落组成和多样性有待进一步研究。此外，作物生物量与更多微生物性质指标之间的关系还需进一步证实。

　　参考文献
　　
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