可耐受40℃高温产纤维素酶菌的产酶条件分析

　　引言

　　纤维素是地球上最丰富的有机资源之一。 纤维素酶是能够协同降解纤维素为葡萄糖的一组酶的总称，它包括内切葡聚糖酶（也称 Cx酶）、外切葡聚糖酶和葡聚糖苷酶等。 纤维素类原料同步糖化发酵（SSF）生产乙醇最早由 William Freder-ick Gauss提出，该工艺为纤维素酶解与葡萄糖的乙醇发酵在同一反应器中进行，生产设备简单，酶解效率高，值得工业推广应用。 同步糖化发酵通常在 35~38 ℃下操作，刘海臣选育出耐高温 40℃的产乙醇酵母 ， 可以使 SSF 的温度提高到 40℃，大大提高了乙醇生产效率，降低了成本消耗。

　　采用混合菌发酵技术可以有效解决 SSF 法中酶费用较高的问题， 用纤维素酶产生菌与乙醇酵母的混合菌进行同步糖化发酵，结果较好。 应用混合菌技术的 SSF 工艺要求产纤维素酶菌株的生长温度与同步糖化发酵过程的高温环境保持一致， 这就促使人们开始对适于同步糖化发酵的产纤维素酶菌株展开研究， 而目前这类研究的报道还较少。

　　本文通过温度驯化培养，将从 30 ℃条件下分离筛选出的一株产纤维素酶菌驯化成耐受 40 ℃的菌株，并对其产酶条件进行研究，以期为同步糖化发酵提供应用基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料
　　1.1.1 菌种来源
　　菌种取自土壤底层的腐烂植物根茎。

　　1.1.2 培养基
　　试验所用富集培养基、纯化培养基、平板筛选培养基、种子培养基、液体发酵培养基和保藏培养基参照文献[7]制备。

　　1.1.3 试剂
　　0.2 mol/L，pH4.8 醋酸-醋酸钠缓冲液； 纤维素酶粗酶液（1 mL 传代培养的发酵液，经 50 mLpH4.8 的醋 酸-醋酸 钠缓冲液浸泡 3 h）；5 g/L 羧甲基纤维素钠缓冲液；DNS 试剂；1 mg/mL 葡萄糖标准液；浓 NaOH 溶液。

　　1.2 试验方法与设计
　　1.2.1 酶活测定方法
　　纤维素酶体系的最主要成分是内切葡聚糖酶，本文以 Cx酶活来表征纤维素酶活。 酶活定义：1 mL 纤维素粗酶液在 1 min 内水解 CMC-Na，生成 1 μg 葡萄糖， 称为 1 个酶活力单位， 用 U/mL表示。 纤维素酶活力测定参照中华人民共和国轻工行业标准《纤维素酶制剂》进行。

　　采用 DNS 法测定还原糖含量。 试验所用的葡萄糖标准曲线如图 1 所示。 线性回归直线方程为Y=3.097 9x-0.010 8，R2=0.999 1。 说明曲线可信度较高，可以应用。【图1】

　　
　　1.2.2 初筛
　　通过富集培养、梯度稀释、初筛、纯化、分离筛选等步骤，于 30 ℃条件下筛选出产纤维素酶菌若干株，根据生长情况择优挑选长势较好的 5 株，分别测定其 Cx酶活力。

　　1.2.3 驯化与复筛
　　采用逐步提高培养温度的方法进行驯化，将初筛得到的 5 株菌分别接种到装有液体培养基的 50 mL 三角瓶中，温度由 30 ℃依次逐级提高为32，34，36，38，40 ℃，摇床上培养 6 d，得到能适应40 ℃环境的 5 菌株 ，分别测定其酶活 ，得 出优势菌株。

　　1.2.4 优势菌株的二次回归正交组合设计
　　确定酶活最高的菌株为优势菌株，以 Cx酶活为目标值（y，U/mL）进行考量，设计二次回归正交组合，考察初始 pH 值、底物浓度、接种量 3 个因素对优势菌株产酶效果的影响。

　　取水平重复次数 m0=1，因素 个数 p=3，查表得星号臂值 γ2=1.476，γ=1.215。 对各因素水平进行编码，得各实际因素 Z 的编码公式为【公式】

　　
　　各因素水平编码表见表 1， 其中上下界水平（+γ 和-γ）根据文献和前期试验基础取得。【表1】


　　
　　2 结果与讨论
　　
　　2.1 初筛结果
　　通过初筛，得到 30 ℃条件下的 5 株产纤维素酶菌，分别标号为 CE1，CE2，CE3，CE4，CE5。其 Cx酶活测定结果见图 2。【图2】

　　
　　从图 2 可以看出，5 株菌的 Cx酶活均呈先增大后减小的趋势， 且菌株 CE5 的 Cx酶活高于其它 4 株菌，其 Cx酶活在第 3 天达最大值，为 29.88U/mL。

　　2.2 温度驯化培养
　　经 40 ℃驯化后的 5 株菌分别标号为 CE1′，CE2′，CE3′，CE4′，CE5′。 其 Cx酶活测定结果见图3。【图3】

　　
　　从图 3 可以看出，驯化后的 5 株菌 Cx酶活与驯化前具有相同的变化趋势，但均比驯化前低。菌株 CE5′Cx酶活高于其它 4 株菌，其 Cx酶活在第 3天达最大值，为 24.73 U/mL。

　　2.3 菌株 CE5′产酶条件分析
　　对优势菌株 CE5′的二次回归正交组合设计和试验结果见表 2，各因素的方差分析见表 3。 方差分析结果表明：经 F 检验，总回归及各项因素均达到显着或极显着水平， 说明所选的 3 个试验因素与菌株 CE5′Cx酶活之间存在显着或极显着的回归关系。回归方程为【表2-3略.公式2】

　　
　　2.3.1 主效应分析
　　将所建立的回归模型的 3 个因子中的其它 2个固定在 0 水平值上，讨论单因子对菌株 CE5′Cx酶活的影响，得到以下 3 个单因子模型。【公式3】

　　
　　画出以上 3 条二次曲线的图形， 图 4 显示曲线 y3最弯曲， 说明接种量的变化对菌株 CE5′Cx酶活的影响最大。 3 个因素对菌株 CE5′Cx酶活的影响顺序为接种量＞初始 pH 值＞底物浓度。【图4】

　　
　　线 y3最弯曲， 说明接种量的变化对菌株 CE5′Cx酶活的影响最大。 3 个因素对菌株 CE5′Cx酶活的影响顺序为接种量＞初始 pH 值＞底物浓度。【公式4】

　　
　　从图 5 可以看出， 随着初始 pH 值和底物浓度的增加， 酶活先逐渐升高， 当初始 pH 值达到0.3 水平附近、 底物浓度达到-0.25 水平附近后，随着初始 pH 值和底物浓度的增加， 酶活逐渐下降。 因此，要使酶活达最大值，X1应取 0.3 水平，X2应取-0.25 水平，代入编码公式（1），（2）计算得到Z1=6.49，Z2=8.55。 即初始 pH 值为 6.49，底物浓度为 8.55 g/L，菌株 CE5′的 Cx酶活最大。（2）初始 pH（X1）与接种量（X3）的交互效应分析将底物浓度 X2固定在 0 水平，得到交互效应方程：【公式5】

　　
　　从图 6 可看出， 随着初始 pH 值和接种量的增加，酶活先逐渐升高，当初始 pH 值达到 0.3 水平附近、 接种量达到 0.2 水平附近后， 随着初始pH 值和接种量的增加，酶活逐渐下降。因此，要使酶活达最大值，X1应取 0.3 水平，X3应取 0.2 水平，代入编码公式（1），（3）计算得到 Z1=6.49，Z3=6.66。 即初始 pH 值为 6.49，接种量为 6.66%，菌株CE5′的 Cx酶活最大。（3）底物浓度（X2）与 接 种 量 （X3）的 交 互 效 应分析将初始 pH 值 X1固定在 0 水平，得到交互效应方程：【公式6】

　　
　　从图 7 可以看出， 随着底物浓度和接种量的增加，酶活先逐渐升高，当底物浓度达到-0.25 水平附近、接种量达到 0.2 水平附近后，随着底物浓度和接种量的增加，酶活逐渐下降。 因此，要使酶活达最大值，X2应取-0.25 水平，X3应取 0.2 水平，代入编码公式（2），（3）计算得到 Z2=8.55，Z3=6.66。 即底物浓度为 8.55 g/L，接种量为 6.66%，菌株 CE5′的 Cx酶活最大。【图5-7】

　　综上所述，从交互效应的分析来看，要使菌株CE5′的 Cx酶活达最大值，各因素的最优水平取值应为初始 pH 值 6.49，底物浓度 8.55 g/L，接种量6.66%。

　　3 结论
　　
　　从土壤底层的腐烂植物根茎中筛选出 30℃条件下的 5 株产纤维素酶菌，其中菌株 CE5 的 Cx酶活最高，达 29.88 U/mL。对筛选得到的 5 株菌逐级进行温度驯化，最终得到一株能够适应 40 ℃的菌株 CE5′，其 Cx酶活可达 24.73 U/mL。 通过二次回归正交组合设计，得出 3 个因素对菌株 CE5′ Cx酶活的影响关系：接种量＞初始 pH 值＞底物浓度。各因素的最优水平取值为初始 pH 值 6.49， 底物浓度 8.55 g/L，接种量 6.66%。