超声波辅助提取香樟果中的黄酮类化合物实验分析

　　超声波的选择性好，穿透能力非常强，非常容易于获得比较较集中的声能，在水中传播距离非常远，应用非常广泛，可用于测速、清洗、碎石杀菌消毒等方面。超声波提取法是利用超声波帮助溶剂进行提取，可以产生高速度、强烈的空化效应和搅拌，破坏植物体内的细胞壁[1],使溶剂分子渗透到植物细胞中，从而缩短了提取时间，提高了提取率，还可以避免温度过高对提取成分的影响。近年来，超声波提取法被普遍应用在天然物的提取方面，超声波技术广泛应用于提取植物中的植物碱、植物体类活性物质等[2 -4],目前黄酮类化合物提取的方法很多，本次实验采用超声波辅助提取香樟果中的黄酮类化合物。

　　1 实验材料

　　仪器： AE240 电子分析天平（ 梅特勒 - 托利多） ,可见分光光度计（ 722N） ,离心机（ TDL5 -100 - A） ,超声波恒温水浴槽（ SBL -30DT） ,高速粉碎机（ JSP -100） .

　　试剂： NaNO3,Al（ NO3）3,NaOH,芦丁标准品 （ 国药集团化学试剂有限公司，含量大于 95%） ,无水乙醇均为分析纯（ AR） .

　　材料： 春香花园网店买回的大叶香樟果。

　　样品预处理： 将买回的成熟的香樟果在 55 ℃下烘至衡重，再粉碎成粉末，装入密封袋中备用。

　　2 实验方法

　　2. 1 吸光度的测量方法

　　在 100 mL 容量瓶中，分别加入 50% 乙醇 5 mL 和 5% 亚硝酸钠溶液 2 mL,混合均匀后静置 6 min,再加 10% 硝酸铝溶液2 mL,混合均匀后静置 6 min,最后加 4% 氢氧化钠试液 10 mL,静置15 min 后，用50%乙醇定容，摇匀后静置15 min,用可见分光光度计以试剂空白为参比，在 510nm 波长处测定吸光度。

　　2. 2 单因素实验

　　称取 2. 0000 g 香樟果粉末于锥形瓶中，分别对乙醇体积分数、时间、超声波功率、温度、料液比等做单因素超声波提取。结束后，冷却离心，再转移至 100 mL 容量瓶中，并用相同体积分数的乙醇溶液定容至刻度线。从中移取 2 mL 溶液于100 mL 容量瓶中定容后按照 2. 1 步骤测定其吸光度，计算黄酮类化合物的提取率，来确定最佳提取条件。

　　2. 3 提取率的计算

　　先由芦丁标准曲线计算出总黄酮的质量，在由计算式得出香樟果中黄酮类化合物的提取率： 黄酮类化合物提取率（ %） =（ C ×100 ×50 ×10- 3） /m ×100%,式中 C 为标准曲线黄酮浓度（ μg/mL） ,m 为样品的质量（ g） .

　　3 结果与讨论

　　3. 1 标准曲线

　　准确称取芦丁标准品 0. 0200 g,并向其中加入 30 mL 无水乙醇，水浴加热搅拌使其溶解，然后将冷却后的溶液转至100 mL 容量瓶，定容备用。准确移取上述制备的芦丁溶液0. 00 mL、1. 00 mL、2. 00 mL、3. 00 mL、4. 00 mL、5. 00 mL、6. 00 mL 分别置于 6 支 100 mL 容量瓶中。按步骤 2. 1,测定其吸光度，以吸光度（ A） 为纵坐标，黄酮类化合物质量溶度（ mg/mL） 为横坐标，绘制如图 1 所示的芦丁标准曲线[5],得到回归方程 y =13. 800x -0. 0040,相关系数 R2= 0. 9985.表明芦丁在0. 00 ~ 0. 10 mg / mL 之间与吸光度值的线性关系。

　　3. 2 单因素实验

　　3. 2. 1 乙醇体积分数对香樟果中黄酮类化合物提取率的影响

　　准确称取 2. 0000 g 香樟果粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，分别加入体积分数为 30%、40%、50%、60%、70% 的40 mL 乙醇，在超声功率 300 W,超声温度 50 ℃ ,超声时间30 min 条件下，进行超声波提取试验。结果如图 2 所示，表明： 黄酮类化合物的提取率随乙醇体积分数的增加先增大后减小，当乙醇体积分数为 40%时提取率长而达最高，50% 时有所下降。其主要原因为在 40%乙醇溶液中黄酮类化合物溶解比较为充分，提取率相对比较高。

　　称取 2. 0000 g 香樟叶粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，分别在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下和在超声功率为300 W,超声时间 30 min,乙醇浓度为 40%,料液比 1∶20 条件下进行超声波辅助提取。结果如图 3 所示，表明： 黄酮类化合物提取率随温度的升高先升高后降低，当达到 50 ℃，提取效果最好。

　　可能是温度比较高可能造成溶剂挥发损失一部分； 也可能破坏了结构，降低了其稳定性，温度升高使分子的运动加速，软化和破坏了细胞壁从而使细胞浸出更多的黄酮类化合物，从而影响其测定，故温度在 50 ℃左右为宜。

　　3. 2. 3 时间对香樟果中黄酮类化合物提取率的影响

　　准确称取 2. 0000 g 的香樟果粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，在超声波时间分别为 20、30、40、50 和 60 min 和超声功率300 W,乙醇浓度40%,超声温度50 ℃，料液比1∶20 条件下进行实验。结果如图 4 所示，结果表明： 黄酮类化合物提取率随时间的延长先升高后降低，当超过 30 min 后，其提取率有所降低。可能是加热时间比较长导致部分黄酮类化合物分解，使得提取率有所降低，因此提取时间 30 min 为宜。

　　3. 2. 4 功率比对香樟果中黄酮类化合物提取率的影响

　　准确称取 2. 0000 g 的香樟果粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，分别在功率为 240、300、360、420、480 W 的条件下和超声时间30 min,乙醇浓度 40%,料液比 1∶20,超声温度 50 ℃条件下进行超声处理试验。结果如图 5 所示，随着超声功率的增大，黄酮提取率先增大，当超声功率达到 300 W 以上时，黄酮提取率减小。由于超声波工作的功率本身不宜过高，而且在高功率条件下运行时产生较大的噪音，影响黄酮类化合物的提取，所以本次确定功率 300 W 为最宜。

　　准确称取 2. 0000 g 的香樟果粉末 5 份分别置于 5 个锥形瓶中，分别在液料比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的条件下和超声功率为 350 W,超声时间 30 min,超声温度 50 ℃，乙醇浓度为 40%的条件下进行超声处理。结果如图 6 所示，表明： 黄酮类化合物提取率随料液比的升高先逐渐上升后逐渐下降，当达到 1∶20 时达到最高。

　　3. 3 正交实验

　　由单因素的实验结果表明，选取时间、液料比、体积分数，超声波功率为四因素选择三水平进行表格设计，根据实验数据可知温度对提取率的影响比其他因为较小，故选择温度为最佳值50 ℃，见表1.设计 L9（ 34） 正交表来进行正交实验。操作： 分别准确称取 2. 0000 g 香樟果粉末于锥形瓶中，按正交表进行实验，得出黄酮提取液，配制成 100 mL 溶液，用移液管移取 2 mL 于 100 mL 容量瓶中再按 2. 1 方法测定不同条件下提取液中黄酮类合物的吸光度，并计算出提取率。

　　由表 2 可知，各因素的影响顺序为 体积分数 > 功率 > 超声波时间 > 液料比。其中体积分数的极差最大，即最大影响因素。结果分析，A2B2C1D2（ 液料比 1∶20、体积分数 40%、温度50 ℃、超声波时间 30 min） 为最佳工艺提取条件。

　　3. 4 验证实验

　　在温度 50 ℃的条件下，按提取最佳工艺 A2B2C1D2的条件进行提取。提取后的溶液移取 2 mL 溶液于 100 mL 容量瓶中按照 3. 1 的实验方法测定吸光度，进行 3 次平行实验验证，提取率 分 别 为 2. 512%、2. 497%、2. 503%, 平 均 提 取 率 为2. 504% ,为最大值。

　　4 结 论

　　本次实验利用超声波提取法提取香樟果中的黄酮类化合物的研究，并分别考察了温度、乙醇体积分数、功率、时间、料液比对本实验提取率的影响，采用了可见分光光度计测定了香樟果中黄酮含量的吸光度，并计算出黄酮类化合物的含量。通过单因素实验和正交试验确定了最优提取条件为： 温度为50 ℃ ,乙醇的体积分数为 40% ,时间为 0. 5 h,料液比为 1∶20.在最佳条件下总黄酮化合物的提取率能够达到 2. 504% .

　　参考文献

　　[1] 仇燕，仇彦博。 柚皮总黄酮超声波辅助提取工艺的研究[J]. 河北科技大学学报，2010,31（ 4） : 330 -333.

　　[2] 吕萍。 超声波法提取柚皮中黄酮的最佳工艺研究[J]. 吉林农业科技学院学报，2012,21（ 2） : 14 -16.

　　[3] 刘祥义。 超声波提取元宝枫叶总黄酮方法研究[J]. 云南化工，2003,23（ 1） : 27 - 28.

　　[4] 谢明杰，宋明，邹翠霞，等。 超声波提取大豆异黄酮[J]. 大豆科，2004,23（ 1） : 75 - 76,74.