细胞衰老与癌症治疗研究

　　细胞衰老论文（8篇无删减范文）之第四篇

　　摘要：细胞衰老是生物界普遍存在的现象。肿瘤细胞是一类摆脱细胞周期束缚,突破Hayflick界限,能够无限增殖而不衰老的细胞。癌症是一种与细胞衰老密切相关的疾病。从进化的角度来看,衰老对于生物体是有益的,可以导致细胞不可逆的周期阻滞,被认为是一种自主的肿瘤抑制机制。在恶性增殖的癌细胞中,在胞外及胞内多种刺激下,如端粒缩短、DNA损伤、氧化应激以及化疗药物的处理等,都会出现细胞周期阻滞,生长迟缓等细胞衰老现象。诱导肿瘤细胞衰老也被认为是一种治疗癌症的有效手段。衰老细胞可以向胞外分泌数十种因子,维持细胞自身衰老表型,并影响周围细胞的生长,这种特性被称为衰老相关的分泌表型(SASP)。本文详细综述细胞衰老的形态学特征与分子标记物及检测方法,细胞衰老的信号调控通路(p53-p21,p16-pRB和PTEN-p27),以及细胞衰老与恶性肿瘤发生发展的关系等。尤其是应激压力诱导下的细胞衰老在癌症治疗中的潜在作用,并进一步讨论当下流行的促衰老癌症治疗的靶点与药物以及存在的问题,以期为今后的研究提供新思路和新方向。

　　关键词：细胞衰老,衰老相关的分泌表型,癌症治疗,促衰老治疗,药物靶点

　　多细胞生物中,衰老现象普遍存在,主要表现在分子、细胞、组织和器官水平上发生一系列功能的退化或丧失。Hayflick等[1]于1961年首次描述了体外培养细胞的衰老现象,即体外培养正常二倍体细胞,经过特定分裂次数的快速增殖期后,细胞增殖活力逐步下降,停止有丝分裂,直到细胞死亡。这一细胞分裂的限制被称为Hayflick 界限,而这种细胞衰老方式被称为复制性衰老(replicative senescence)。随后发现,当细胞暴露于不同刺激时,如活性氧(reactive oxygen species, ROS)、DNA损伤试剂和原癌基因的激活等,也可以诱发与衰老细胞相似的表型,即细胞会出现永久的和不可逆细胞增殖停滞,并把这一类细胞衰老叫作早衰(premature senescence)或者压力应激诱导的衰老(stress induced premature senescence, SIPS)[2]。这两类衰老的最大区别在于,复制性衰老随着细胞分裂次数的增加端粒逐渐缩短,而压力应激诱导的衰老则没有端粒的缩短。

　　肿瘤的发生同样与细胞衰老密切相关。从遗传上来说,肿瘤细胞是随着细胞增殖次数的增加,原癌基因或抑癌基因的突变不断累积,是一类摆脱衰老束缚,突破Hayflick界限,能够无限增殖的细胞。近年来,随着体内衰老标志物的发现,化疗药物治疗后的癌细胞中也发现了衰老细胞。因此,通过外界药物或刺激的干预,诱导肿瘤细胞衰老,逆转肿瘤细胞不受衰老束缚的表型,可以抑制肿瘤尤其恶性肿瘤的增殖与转移,也是一种潜在的治疗癌症的手段。在本文中,将从细胞衰老的分子标志物、信号通路,以及细胞衰老在癌症治疗中的潜在作用等方面,系统阐述促衰老在癌症治疗中的最新进展。

　　1 细胞衰老标志物

　　López-Otín等[3]将生物体(特别是哺乳动物)衰老的特征归纳为9个特征:基因组失稳,端粒损耗,表观遗传学改变,蛋白质稳态丧失,营养素感应失调,线粒体功能障碍,干细胞耗竭以及细胞间通讯改变等。细胞衰老是生物体衰老的基础,因此单个细胞衰老大都也具有上述特征。在应激条件下的衰老细胞和衰老的正常二倍体细胞,均表现出一系列衰老细胞形态学特征,如细胞形态大而扁平,失去规则形状,细胞表面布满颗粒,细胞界限变得不明显,生长速率减慢等。

　　除了形态学的改变,已经发现一系列细胞衰老的标志物。衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal)活性的增加是衰老细胞和衰老组织的重要标志物之一,也是目前衰老研究最常用的标志物[4]。新鲜的衰老组织或细胞用X-Gal (5-Bromo-4-chloro-Indoly-β-D-Galactoside)染色,该底物可被SA-β-Gal在酸性条件下裂解,产生不溶的蓝色结晶,在光学显微镜下,胞质中可以看到明显的蓝色。SA-β-Gal活性增加,是由于衰老细胞中溶酶体累积所致,还未发现与细胞信号调控途径有关。衰老细胞的另一典型特征是发生异染色质凝集,凝集的异染色质在细胞核纤层区域形成衰老相关的异染色质焦点(senescence-associated heterochromatin foci, SAHF)[5,6]。SAHF不仅可用于检测体外培养的衰老细胞,而且也可检测体内的衰老细胞,经DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)染色后,在荧光显微镜下可观察到细胞核中出现点状的异染色质结构[7]。SAHF可以沉默或抑制转录因子E2F调控的相关基因表达,例如:DNA复制准许因子MCM3(minichromosome maintence 3)、PCNA (proliferating cell nuclear antigen)或周期蛋白A(cyclin A)等,SAHF受到细胞衰老关键调控因子p16和p53的调节[8,9]。核纤层蛋白B1(lamin B1)丢失也是细胞衰老的一个分子标志[10,11]。核纤层蛋白B1的丢失主要归因于mRNA稳定性的丧失,而与核纤层蛋白B1的翻译后修饰以及降解无关。核纤层蛋白B1的丢失受细胞衰老调控因子p53以及pRB(retinoblastoma, RB)信号分子的调控,但不依赖于p38有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核转录因子NF-κB和毛细血管扩张性共济失调突变基因(ataxia-telangiectasia mutated, ATM)信号[10]。

　　衰老细胞的代谢模式已发生显着变化,但生理代谢仍然十分活跃。衰老细胞可以向胞外分泌数10种因子,维持细胞自身衰老表型,并影响周围细胞的生长,这种特性被称为衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)[12]。这些因子包括,炎性细胞因子,例如白细胞介素(IL-6,IL-8,IL-1α和 IL-1β等);趋化细胞因子,例如类胰岛素生长因子结合蛋白7等;生长因子,例如GROα(growth-regulated oncogene α)、GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)和VEGF(vascular endothelial growth factor)等;促进肿瘤细胞侵袭和转移的蛋白酶类,例如基质金属蛋白酶MMPs(matrix metalloproteinases)等,例如MMP-2和MMP-9等可以水解细胞外基质,促进肿瘤细胞侵袭和转移;MMP-1和MMP-3可以断裂IL-8,IL-1 和VEGF等因子,促进这些因子分泌。这些SASP因子不仅是细胞衰老的标志物,同时也是维持衰老细胞存活所必需的[13]。

　　2 细胞衰老的分子机制

　　目前研究发现,肿瘤抑制蛋白质p53和pRB(retinoblastoma protein)参与细胞衰老的激活与维持,且二者都可以在端粒缩短和多种压力应激的作用下被激活。在小鼠体内,p53和pRB任何一个基因的失活都会使细胞避免衰老。而在人类细胞中,p53和pRB的失活尽管不能完全避免细胞衰老,但都能显着延缓细胞衰老进程[14,15]。此外,p27kip1(protein 27 kinase inhibition protein 1)是细胞周期依赖性激酶抑制剂,属于G1/S期负调控因子,可以抑制细胞进入S期,p27 kip1受磷酸酶及张力蛋白同源基因 (phosphatase and tensin homology, PTEN)脂质磷酸酶活性的调控,因此PTEN-p27也是细胞衰老主要调控途径[16]。

　　2.1 p53-p21途径

　　p53是一个经典的肿瘤抑制因子,在人类50%的癌症中,p53都会发生突变[17]。在正常细胞中,p53的表达通过负反馈调节维持在较低的水平,当p53激活时,通过诱导细胞周期阻滞、凋亡或衰老,有效抑制细胞增殖[18]。在细胞衰老过程中,p53的一个重要靶点是周期蛋白依赖激酶抑制剂p21。p21可以拮抗周期蛋白-CDK复合物的活性,并能将细胞周期阻滞在G1或G2期。p21过表达能引起衰老样细胞周期阻滞,而p21删除则能延缓衰老相关的周期阻滞[19]。p53在衰老过程中通过诱导p21发挥作用,因此这条通路也被称为p53-p21途径。

　　p53-p21通路主要负责端粒缩短以及DNA损伤引起的衰老。DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)会诱发DNA损伤反应(DNA damage response, DDR), ATM激酶激活p53,引起细胞周期阻滞并导致衰老。化疗药物可诱导细胞衰老,如博莱霉素、阿霉素和丝裂霉素等,从而提供了衰老始于DNA双链断裂的最直接证据。缩短的端粒或功能失调的端粒,不能有效保护染色体,形成了类似DNA双链断裂的结构,并诱发p53依赖性的DNA损伤反应,导致ATM/ATR和Chk1/Chk2的激活,最终使G1检查点机制的激活[20,21]。细胞对这种DNA损伤的反应是在断裂DNA周围聚集大量的蛋白质复合物,以稳定DNA结构并为后续修复做好准备。

　　2.2 p16-pRB途径

　　pRB是细胞周期负调控因子,可将细胞周期阻滞在G1期。人类细胞中,pRB的失活是避免衰老所必需的。这表明,pRb在细胞衰老中发挥至关重要的作用。细胞周期抑制因子p16是pRB的主要调控因子。pRB主要通过抑癌基因p16途径使细胞发生衰老,因此这条通路也被称为p16-pRB途径[22]。p16作为一种细胞周期依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKI),可以特异性抑制cyclin D-CDK4/6-pRB的磷酸化过程,使pRB处于非磷酸化的活性状态[23]。pRB蛋白以非磷酸化的活性形式与E2F蛋白结合,从而阻断靶蛋白质—细胞周期进展的效应因子的转录激活。p16的功能是保持pRB处于活跃的生长抑制状态,从而阻断E2F转录因子调控的基因表达,造成G1期周期阻滞。p16-pRB途径可能与衰老的致密异染色质形成有关[24]。比较有趣的是,一旦衰老细胞中p16-pRB信号通路建立,衰老细胞生长停滞不能通过随后的p53失活、p16沉默或pRB失活来逆转[19]。可能原因为,一旦pRB建立在E2F靶基因位点或可能的位点上形成高度压缩的异染色质,似乎维持异染色质不再需要p16或pRB活性。因此,p16-pRB通路对于保证衰老生长停滞本质上是不可逆的,这些发现可能有助于解释衰老细胞显着稳定性的理论。

　　2.3 PTEN-p27途径

　　磷酸酶及张力蛋白同源基因是第1个被发现的具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因,在很多的癌细胞中都存在表达缺失的现象。PTEN可以通过其脂质磷酸酶活性使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphoinositide trisphosphate, PIP3)去磷酸化,从而抑制PI3K/AKT通路,因此PTEN被认为是PI3K/AKT通路的负调控因子[25]。p27kip1是细胞周期依赖性激酶抑制物,能够广泛抑制多种细胞周期蛋白和激酶的活性。p27在G0期和G1期早期高表达,抑制cyclin E-CDK2等激酶复合物的活性,阻止细胞进入S期[26]。同时,p27也是一种抑癌基因,在正常组织中表达非常高,在恶性肿瘤中的表达显着下降,但很少出现突变。在肿瘤细胞中,p27受到多条信号原癌基因信号通路的调控,其中PI3K/AKT信号通路是主要调控途径。在癌细胞中,Pten基因往往发生突变,不能翻译PTEN蛋白,PIP3不能脱磷酸,在胞内积累较多的PIP3,导致下游的PI3K/AKT信号通路激活。PTEN可以通过其脂质磷酸酶活性,上调p27的表达并通过其蛋白磷酸酶活性,下调cyclin D1的活性抑制细胞周期阻滞在G1期[27]。

　　3 细胞衰老在癌症发生发展中的作用

　　3.1 肿瘤细胞衰老可以抑制肿瘤的恶性转变

　　在癌前肿瘤,例如肺腺瘤(lung adenomas)、胰腺导管内肿瘤(pancreatic intraductal neoplasias)、前列腺上皮内肿瘤(prostate intraepithelial neoplasias)和黑色素细胞痣(melanocytic nevi)等良性肿瘤中,都发现了衰老的肿瘤细胞。但在相应的恶性阶段,例如肺腺癌、胰腺导管腺癌、前列腺腺癌和黑色素瘤等中,均未发现衰老肿瘤细胞[28,29]。所有这些证据都有力地表明,衰老是肿瘤恶性发展的一个障碍,可以有效抑制肿瘤恶性转变。特定癌基因的激活或抑癌基因的失活可以诱导衰老进程,以帮助细胞建立一个持久的细胞周期阻滞。例如,在黑素细胞痣中,具有致癌BRAF突变的黑素细胞会衰老并保持良性[30,31]。在早期前列腺瘤、结肠腺瘤、星形细胞瘤和神经纤维瘤中,也检出衰老标志物[32,33,34]。同样,抑癌基因的失活,也可以诱导肿瘤衰老,如Pten,Csnk1a1及Pttg1的失活都可以诱发细胞衰老[35]。这些结果表明,衰老与肿瘤恶性转变前阶段密切相关,但可能与恶性癌症无关。

　　3.2 癌细胞可以被直接诱导衰老

　　诱导癌细胞衰老被认为是一种可靠的肿瘤治疗策略。就体外培养的人类癌细胞而言,肿瘤细胞在致死剂量接受化疗或放疗后出现细胞死亡现象,但在亚致死剂量的情况下,往往会使细胞发生衰老[36]。例如,阿霉素可以诱导DNA损伤和ROS产生,高剂量的阿霉素导致细胞凋亡,而低剂量阿霉素(约1/10)可通过细胞衰老进而抑制细胞增殖[37]。诱导衰老的药物与经典的治疗药物结合,一方面可以减少化疗剂量,另一方面也可解决肿瘤细胞对死亡的抗性。5-氟尿嘧啶和萝卜硫素共同作用乳腺癌细胞MDA-MB-231时,可通过自噬性细胞死亡和促衰老两种效应,协同增强抗肿瘤效应[38]。随着衰老在肿瘤防治中发挥着越来越重要的作用,衰老诱导在甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌等肿瘤中得到了广泛应用。

　　3.3 SASP对肿瘤的双刃剑作用

　　SASP具有一定的抑制肿瘤的作用。衰老细胞分泌的SASP因子,例如IL-6、IL-8和IGFBP-7(insulin-like growth factor-binding protein 7)等因子,以自分泌正反馈环路方式加强细胞衰老,降低癌基因RAS、BRAF等激活导致细胞转化和转移等风险[39,40]。衰老细胞分泌的免疫调节因子,例如IL-1、MCP1(monocyte chemotactic protein 1)和CTACK(cutaneous T cell-attracting chemokine)等可以激活免疫系统,清除衰老的细胞,在肿瘤的发生发展中发挥一定的预防作用[40,41]。但在肿瘤细胞中SASP的作用,更倾向于促进肿瘤的发生及转化。主要体现在以下几个方面:(1) SASP成分为肿瘤提供一个免疫抑制微环境,促进肿瘤免疫逃逸。例如,VEGF可以促进肿瘤的血管生成,TGF-β可以作为一种免疫抑制剂;(2) SASP 促进肿瘤的侵袭和转移。SASP中的基质金属蛋白酶可降解细胞外基质,重塑肿瘤微环境结构,有助于肿瘤细胞运动、侵袭和转移。

　　4 基于促衰老机制的癌症治疗

　　4.1 以端粒酶为靶点的癌症治疗

　　在癌细胞中,端粒酶和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)活性显着升高,使得端粒在细胞复制后不缩短,是癌细胞摆脱衰老束缚的主要机制之一。许多研究者都将注意力集中在鉴定抑制癌细胞端粒酶活性的化合物或者发展一些新的策略,从而导致端粒完整性的丧失及衰老的诱导。这些方法包括:靶向端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)的反义寡核苷酸,靶向端粒酶的小分子药物,寡核苷酸和核苷等(见Table1)。3-叠氮-2,3-二脱氧胸苷(zidovudine,AZT,齐多呋定)是报道的第1个端粒酶抑制剂。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验结果显示,在多种实体瘤中单独或联合用药时,肿瘤均有一定的消退[42]。BIBR1532是一种抑制端粒酶活性的小分子化合物,是TERT和hTR非竞争性的抑制剂,负责缩短端粒长度、抑制细胞增殖和诱导衰老[43,44]。反义寡核苷酸伊美思他(imetelstat或GRN163 L)是由13个寡核苷酸与一种脂质偶联的复合物,当其与hTR互补结合,可在体外显示出良好的结果,在临床试验的结果也比较乐观[45,46]。针对免疫治疗, hTERT来源的肽疫苗可以使免疫细胞对表达hTERT的肿瘤细胞敏感,来达到抑制肿瘤生长的目的。多种不同免疫肽的临床试验正在进行中,其中最有希望的是GV1001 (tertomotide)。GV1001是一种Ⅱ型MHC限制性肽疫苗,包含来自hTERT活性位点的16个氨基酸,已经在韩国上市。虽然靶向端粒酶逆转录酶和端粒酶的治疗还未大规模应用于临床,但这种治疗方法是最有前途的方法之一[47],并有可能成为通用癌症疫苗。

　　4.2 以细胞周期阻滞为靶点的治疗

　　衰老细胞的另一个主要特征是CDKs抑制剂表达增加和随后在细胞内累积,例如p16INK4a、p15、p27和p21CIP1/WAF1等。因此,提高CDKs抑制剂的表达或抑制CDKs活性的药物,都可以用于癌症的促衰老治疗(见Table 1)。小分子化合物MLN4924(pevonedistat),可影响Skp2-SCF复合物的形成,抑制p27的泛素化降解,使胞内p27水平提高,诱导细胞发生衰老[48]。目前,MNL4924已经在淋巴瘤、多发性骨髓瘤和非血液学恶性肿瘤的治疗中显示出潜在的应用,正在I期临床试验中进行测试。此外,目前可以有效抑制细胞周期阻滞的化合物是CDKs抑制剂。此类化合物可以阻止视网膜母细胞瘤基因编码的蛋白pRB的磷酸化,从而使细胞周期阻滞在G1期。为此,目前已经开发出几种CDK4/6的抑制剂,这些抑制剂可以有效诱导细胞衰老,例如LY2835219(abemaciclib)[49]、PD0332991(palbociclib)[50]和LEE011 (ribociclib)[51]等。它们作为药物,在临床前和临床研究中均展示出对几种癌症良好的治疗前景,且应用高通量扫描等手段,已经在癌细胞中发现能引起衰老的药物靶点,已经被美国FDA批准上市,用于乳腺癌的治疗。此外,使用维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病,通过palbociclib抑制细胞依赖性激酶4(CDK4)和CDK6活性诱导肿瘤细胞衰老,可以改善患者的预后[52]。

　　4.3 以p53为靶点的促衰老治疗

　　鉴于p53及p53-p21在细胞衰老过程中的重要作用,直接或间接靶向p53是一种潜在的促衰老癌症治疗方法。p53在癌细胞中存在多种状态,或突变,或缺失,或以野生状态存在。因此,以p53为靶点的促衰老癌症治疗,要区分p53的不同状态(见Table 1)。在野生型p53的肿瘤中,例如MKN-45、NUGC-4和SUN-1细胞,一种策略是通过抑制MDM2/p53复合物的形成,加强p53功能。Nutlin-3是最早发现的MDM2拮抗剂,它能抑制p53与MDM2相互作用[53]。随后,又发现了一系列具有更高的选择性和效果更好的抑制剂,例如RG7112 (RO5045337),并且是第1个MDM2抑制剂已经进入I期临床[54]。另一种策略是靶向调控p53活性的去乙酰化酶SIRT1。SIRT1可以通过去乙酰化p53导致其泛素化和降解,从而抑制p53功能。因此,SIRT1抑制剂可以导致p53以高度乙酰化的形式存在,发挥p53促衰老功能[55]。一些SIRT1抑制剂,例如sirtinol、suramin、tenovins、 EX-527和cambinol等,已经被证明可以在临床前肿瘤模型中诱导衰老[56]。而在p53突变的肿瘤中,主要使用p53恢复野生型活性的小分子,例如CP-31398、PRIMA-1、MIRA-1、APR-246 (PRIMA-1类似物)和ellipticine,均能促进肿瘤细胞衰老[57,58,59,60]。这些药物与突变p53相互作用,使p53结构发生改变,恢复野生型p53活性,使其能正常转录激活p53靶基因。相反,在p53缺失的肿瘤细胞中,则可通过p53腺病毒感染细胞,使细胞内p53恢复表达,并可以诱导衰老。在我国Gendicine和H101这两种表达野生型/p53的重组腺病毒,已经被批准用于头颈部鳞状细胞癌的治疗[61,62]。

　　4.4 以SASP为靶点的治疗

　　衰老细胞分泌的SASP有助于肿瘤细胞逃避衰老治疗和免疫系统的监督,并促进邻近细胞的增殖或侵袭,导致癌症复发。以SASP为靶点的治疗,主要集中在3个方面:永久移除衰老细胞,免疫介导衰老细胞清除和SASP的中和(见Table 1)。前两个方面主要涉及机体自身的免疫系统,但在临床方面的进展缓慢。抑制SASP促癌成分,和其它的化疗协同治疗肿瘤是一种很有前景的肿瘤治疗或肿瘤放化疗后辅助治疗手段。细胞膜上结合形式的细胞因子IL-1α,可以通过近分泌机制,激活细胞膜上IL-1α受体。因此,阻断IL-1受体信号通路的化合物可能具有预防或抑制SASP的作用[63]。抑制p38MAPK信号通路,同时可以抑制SASP的表达。因此,靶向p38MAPK的抑制剂在体内也可能是SASP的有效抑制因子。临床上,糖皮质激素(皮质酮和皮质醇)已被用于治疗多种炎症性疾病。最近研究证明,糖皮质激素可以抑制几种SASP因子的表达和分泌,有助于抑制SASP的促癌作用[64]。另外,mTOR是SASP的关键调控因子,雷帕霉素对mTOR的抑制可通过4EBP1调控MK2激酶的翻译,进而抑制SASP因子的表达来实现[65]。mTOR的抑制阻止了SASP的致瘤作用,但它也干扰了诱导旁分泌衰老和衰老监督,这是衰老的两个重要的肿瘤抑制武器。此外,mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin),可通过降低IL-1的翻译和NF-B信号通路,来降低SASP (IL-6)和破坏衰老成纤维细胞在体内支持肿瘤生长的能力[66]。总之,这些研究强调了以SASP重新编程作为潜在癌症治疗策略的重要性。因此,在不影响SASP抑瘤功能的前提下,鉴定并特异减弱SASP“黑暗面”的化合物,可用于临床提高其它促衰老化合物的治疗效果。

　　5 问题与展望

　　肿瘤细胞衰老可由肿瘤内部和外界刺激等多种机制诱导,并可对肿瘤的发生、治疗效果和肿瘤预后产生有益和有害的影响。由于缺乏深入的体内分析,这些不同的衰老细胞类型,以及它们对肿瘤细胞影响的详细分子机制,仍然未完全了解。衰老细胞在不同肿瘤类型中的作用似乎是相对可变的,进一步了解这些差异是癌症和衰老治疗的一个重要考虑因素。衰老细胞对癌症的有害影响,尤其是SASP,在某些情况下似乎超过了其有益影响。因此,需要对来自不同衰老机制的衰老细胞SASP之间的差异进行深入研究,以及这些SASP成分如何促进免疫吸引和抑制,将会是促衰老治疗癌症的关键。鉴于免疫监测在肿瘤发生和细胞衰老中的复杂作用,需要在具有免疫能力的动物模型中开展实验,才能得到有意义的结果。

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