间隔性高糖条件对成骨细胞形态、增殖及功能蛋白表达的作用

　　研究发现，糖尿病患者较正常人更易于发生骨量减少和骨质疏松症。其发生机理至今尚未明确，多项临床研究显示，与持续性高血糖相比，间歇性高血糖对糖尿病患者的微血管及大血管损伤更为显著，并可增加心血管死亡风险。

　　然而，间歇性高血糖对成骨细胞乃至骨的影响，目前尚无相关研究。因此，本实验中我们以小鼠颅骨成骨细胞为研究对象，研究间歇性高糖环境对于成骨细胞的形态、细胞增殖及功能蛋白表达的影响。

　　1、对象与方法

　　1.1实验对象

　　取出生3日内的健康新生KM小鼠（购自福建医科大学动物实验中心），拉颈处死，75%酒精中浸泡20min后，取出颅骨，剔除附着于颅骨上的结缔组织及骨膜，PBS冲洗至其呈白色后，用眼科剪将颅骨剪碎成1mm×1mm×1mm的碎骨片，将其用0.25%胰蛋白酶于37℃恒温下消化10min，吸弃消化液，加入0.2%的Ⅱ型胶原酶中37℃消化20min，收集消化液，重复3次。将消化液置于离心管中，1500r/min离心8min，去上清，所得白色沉淀即为成骨细胞。加入含有15%胎牛血清与1%双抗的HDMEM培养基重悬细胞，将其接种于培养瓶中。细胞在37℃、5%CO2、95%O2、100％湿度的孵箱中培养。根据细胞生长情况以及培养液pH值变化选择2～3天换液一次，待细胞80％～90％融合时传代，传代后，改用含有10%胎牛血清与1%双抗的LDMEM培养基培养细胞。BCIP/NBT碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞，细胞传代接种。

　　对数生长期的第3代成骨细胞随机分为3组：5.5mmol/L正常糖浓度组、25mmol/L持续性高糖组、5.5mmol/L～25mmol/LQD间歇性高糖组，分别检测干预1w、2w及3w后成骨细胞形态学变化，收集上清液OCN及ALP分泌情况取第三代成骨细胞，调整细胞终密度为5000个/孔，细胞接种于96孔板中，共设四块平行培养板置培养箱中培养24h，观察大部分细胞已经贴壁，吸弃培养基。将细胞分成上述3个组，每个浓度组设5个重复孔（含不同糖浓度培养基、含细胞）和3个空白孔（即只含培养液、不含细胞），培养液总体积均为200μL/孔，培养48h、72h后，每孔避光加入20μLMTT溶液，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物溶解，于490nm波长处测定各孔吸光度（OD）值，取平均值。

　　1.2实验方法

　　用放射免疫法（RIA）检测细胞上清液中骨钙素含量，比色法检测细胞上清液中碱性磷酸酶（ALP）的含量。

　　1.3统计学分析

　　所得数据均采用SPSS17.0软件系统分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，对符合正态分布的计量资料，组间指标的比较均采用独立样本的t检验。对非正态分布的资料，进行对数转换，若无法转换，则采用非参数秩和检验进行组间比较，以P＜0.05为差别有显著性意义。

　　2、结果

　　2.1不同糖浓度环境对成骨细胞形态学的影响在正常糖浓度环境下，各组成骨细胞形态未见明显变化（图1A）。在高糖环境下，随着干预时间的延长，细胞形态逐渐出现变异，以3w组最为明显。间歇性高糖组（图1C）较正常糖浓度组及持续性高糖组（图1B）细胞生长能力明显减弱，细胞间连接融合减少，部分细胞呈多角形，细胞浆内颗粒增多，细胞核边缘模糊，部分核已裂解。可见部分细胞脱壁漂浮。

　　2.2MTT法检测不同糖浓度环境下成骨细胞增殖能力的影响成骨细胞在正常糖浓度、持续性高糖环境及间歇性高糖环境（Q12H波动）下干预48h和72h后的OD值如表1所示。在相同干预时间点，间歇性高糖组OD值明显低于正常糖浓度对照组及持续性高糖组，差异有具有统计学意义（P＜0.05），并且随着干预时间的延长，各组OD值呈下降趋势，组间两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

　　2.3不同糖浓度环境对成骨细胞OCN和ALP分泌的影响分别用正常糖浓度、持续性高糖、间歇性高糖（QD波动）培养基干预1w、2w和3w后收集各组细胞培养上清液，检测各干预组细胞OCN和ALP的分泌量，分别采用所测得上清液中OCN或ALP浓度/细胞总蛋白之比表示，结果如表2所示。

　　（1）比色法检测ALP浓度结果显示，在相同干预时间点，高糖组细胞上清液ALP分泌量低于正常糖浓度组（P＜0.05），并且间歇性高糖组ALP分泌量降低更显著，组间两两比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。随着干预时间的增加，在高糖组中，相同糖环境组上清液ALP分泌量逐渐减少，而正常糖浓度组ALP分泌量逐渐增加（P＜0.05）。

　　（2）采用放射免疫法检测OCN浓度结果显示，在相同干预时间点，高糖组的OCN分泌量低于正常糖浓度组（P＜0.05），并且间歇性高糖组OCN分泌量降低更显著，组间两两比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。随着干预时间的增加，在高糖组中，相同糖环境组上清液OCN分泌量逐渐减少，而正常糖浓度组OCN分泌量逐渐增加（P＜0.05）。

　　3、讨论

　　近年来，糖尿病和骨质疏松症的联系受到广泛关注，研究认为成骨细胞功能受损是糖尿病骨质疏松及骨折风险增加的主要原因，糖尿病患者在其治疗过程中，由于血糖控制不佳及不恰当的使用降糖药物，常常出现餐后高血糖或药物性低血糖，而胰岛细胞及胰岛素靶器官因功能障碍不能对血糖的变化进行反馈调节，使血糖在较大范围内波动。长期暴露在持续性高血糖中，可使各组织和细胞发生适应性调节而产生耐受，而间歇性高血糖抑制了适应性的产生，从而造成更为严重的损害。我们的前期研究已经证实，持续性高糖环境可抑制成骨细胞增殖并促进其凋亡，本研究进一步观察不同高糖干预模式对成骨细胞增殖能力及功能的影响，发现间歇性高血糖对成骨细胞增殖的抑制作用比持续性高糖更为显著，细胞生长及细胞形态变异更为显著，且这一抑制作用表现出时间依赖性。血糖波动通过影响成骨细胞分化、增殖从而影响骨代谢，可能是是糖尿病易发骨质疏松症的发病机制之一。

　　在成骨细胞的功能方面，检测ALP和OCN。ALP是反映骨形成的指标，OCN主要反映成骨细胞的分化和成熟，在成骨细胞分化后期和矿化期表达增高。新近临床研究及动物试验均表明，尽管OCN是成骨细胞分泌的特异性蛋白，但其与糖脂代谢密切相关，包括促进小鼠胰岛细胞增殖及胰岛素的释放、增加脂肪组织的分解以及促进脂肪因子的释放，并与胰岛素敏感性呈正相关，日本2013年4月开展的一项研究表明，OCN水平不仅与糖脂代谢相关，甚至与男性腹主动脉钙化存在相关性。因此，OCN是骨代谢与糖脂代谢相关性疾病之间的桥梁，在预防代谢性疾病的发生过程中起到重要作用。本实验中运用不同糖环境培养基干预1w、2w和3w后，高糖组成骨细胞上清液中ALP和OCN的蛋白表达情况明显低于正常糖浓度组，其中间歇性高糖组降低更为显著。随着干预时间的延长，正常糖浓度组成骨细胞ALP和OCN的分泌量逐渐增加，而高糖组则逐渐减少，间歇性高糖组减少更为显著。可见，与持续性高糖相比，间歇性高糖对成骨细胞的损伤更为严重，能够进一步抑制ALP和OCN的分泌、成骨细胞增殖，导致成骨细胞数量减少，功能受损，是导致糖尿病性骨质疏松的一项重要原因。

　　综上所述，间歇性高糖对成骨细胞产生毒害作用可能与抑制成骨细胞增殖并减少成骨细胞特异型蛋白如ALP和OCN的表达有关，而这一糖毒性作用较持续性高糖环境更为明显，并呈现出时间依赖性。