小鼠骨片MSC分离与培养的方法

    充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC) 是再生医学重要的种子细胞,在许多疾病治疗中呈现出令人振奋的治疗效果.MSC 首先是由Friedenstein 等[1-2]从骨髓中利用其贴壁生长的特性成功分离出来.这种方法后来被许多研究者用来分离人和实验动物来源的骨髓 MSC[3-6].小鼠是用量最大、用途最广、品种最多的实验动物,已广泛应用于生物医学各领域的科学实验.然而令人烦恼的是实验者很难成功的从小鼠骨髓分离到高纯度的 MSC,或者很难实现 MSC 的连续多次体外传代扩增培养[7].究其原因,是因为小鼠骨髓量很少,MSC 含量极少,同时混有大量造血细胞的优势生长,严重影响了 MSC 的分离培养[7].研究发现,MSC 存在于许多组织中[8],本研究将尝试从小鼠骨片中分离 MSC,并建立其分离培养的方法.

    材料与方法

    一、材料

    1. 实验动物 :C57BL/6 小鼠购自军事医学科学院动物实验中心,雄性,7 d 龄.所有实验在符合动物实验伦理要求下进行.

    2. 主要试剂及仪器 :αMEM 基础培养基(美国 Gibco 公司),胎牛血清(美国 Stem cell 公司),D-60 mm 细胞培养皿(美国 Costar 公司),0.2 ﹪胶原酶、β 甘油磷酸钠、地塞米松、胰岛素、1- 甲基 -3 异丁基 - 黄嘌呤、吲哚美辛、维生素 C、油红O(美国 Sigma),碱性磷酸酶染色试剂盒(美国Sigma),胰蛋白酶(美国 Amresco 公司),PE、FITC或 PERCP 标记抗小鼠单克隆抗体 CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1(美国 BD 公司),CO2培养箱(美国 Thermo 公司),眼科镊,眼科剪.

    二、方法

    1. 小鼠骨片 MSC 分离培养 :C57 小鼠经脱颈处死后,75 ﹪酒精浸泡消毒 10 min.用眼科剪横向剪开皮肤和肌肉,用眼科镊拨开露出小鼠胫骨和股骨,剥离胫骨和股骨,从胫骨头和股骨头处剪断,放入预先放有培养基的培养皿中.用 1ml 注射器吸取基础培养基反复冲洗骨髓腔内的骨髓直至骨片呈白色.将骨片剪碎,加入胶原酶Ⅰ(2 mg/ml)2 ml,37℃消化 1 ~ 2 h,加入胎牛血清终止消化.加入 αMEM 洗涤骨片,将骨片转移到新的培养皿中,加入新鲜配制的含胎牛血清 10 ﹪(v/v)和双抗 0.1 ﹪(v/v)的完全培养基,37℃、5 ﹪ CO2培养箱培养 3 ~ 4 d.加入 0.25 ﹪胰酶消化 3 min,收获 MSC,按 1:3 传代培养,每2 ~ 3 d 更换培养基 1 次.残留的骨片可继续培养获得更多的原代 MSC.收获 P2,P3 代细胞进行实验研究.

    2. 流式鉴定 :收获 P2 代小鼠 MSC,经 PBS洗涤 2 次,加入 PE、FITC 或 PERCP 标记抗小鼠CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1 单克隆抗体避光孵育 30 min,加入 PBS 洗涤 2 次,1500 rpm 离心 5 min,重悬细胞,进行流式测定.FlowJ 7.6 软件进行数据分析.

    3. 成 骨 诱 导 分 化 及 鉴 定 :取 P3 代 小 鼠MSC,以每孔 2×104细胞数种植于 24 孔板中,60 ﹪ ~ 70 ﹪融合时,更换为成骨诱导培养基,含胎牛血清 10 ﹪(v/v),β 甘油磷酸钠 10 mmol/L,地塞米松 10-7mol/L,维生素 C 50 μmol/L.每 3 ~ 4 d 更换培养基 1 次,诱导 2 ~ 3 周后进行碱性磷酸酶染色鉴定.步骤为吸弃培养基,4 ﹪多聚甲醛固定 30 min,去离子水洗涤 2 次,加入 ALP 染料混合液,室温孵育 30 min,去离子水洗涤 2 次,每次2 min,加入苏木素复染 10 min,去离子水洗涤,倒置相差显微镜下观察.

    4. 成 脂 诱 导 分 化 及 鉴 定 :取 P3 代 小 鼠MSC,以每孔 2×104细胞数种植于 24 孔板中,60 ﹪ ~ 70 ﹪融合时,更换含胎牛血清 10 ﹪(v/v),地塞米松 10-6mol/L,胰岛素 10 ng/ml,1- 甲基 -3异丁基 - 黄嘌呤 0.5 μmol/L,吲哚美辛 10-4mol/L的成脂诱导培养基,每 3 ~ 4 d 更换培养基 1 次,2 周后进行油红 O 染色鉴定成脂细胞.步骤为吸弃培养基,PBS 洗涤 1 次,加入 4 ﹪多聚甲醛固定 30 min,70 ﹪异丙醇洗涤 2 次,加入 2 ﹪油红O 室温下染色 10 ~ 15 min,弃去油红 O 染料,异丙醇洗涤残留油红 O,倒置显微镜下观察细胞内脂滴.
 

    结 果

    1. 小鼠骨片分离清洗 :小鼠胫骨和股骨较小,约 牙 签 大 小,可 见 骨 腔 内 红 色 骨 髓(图1 a ),用 1 m l 注 射 器 吸 取 α M E M 培 养 基 冲洗髓腔骨髓后,颜色变白(图 1b).

    2. 小鼠骨片 MSC 原代培养 :小鼠骨片培养 2d 后就可以看见骨片边缘爬出长梭形细胞,3 d 后爬出细胞越来越多,并成集落样生长(图 2).消化细胞进行传代后,可获得纯度较高的 MSC,并且细胞增殖速度较快,3 d 就可达到 90 ﹪融合.

    获得的 MSC 可以连续传代数代,仍然保持良好的细胞形态和增殖能力(图 3).残留的骨片还可以继续作为原代 MSC 的来源继续培养,经过数次培养后,骨片逐渐疏松,除 MSC 外,残留骨细胞(图 4).

    3. 流式鉴定结果 :流式细胞仪结果显示,获得的细胞表达 Scal(192.7 ﹪),CD29(98.4 ﹪),CD90(91.6 ﹪)等 MSC 标志物,不表达 CD34(1.57 ﹪),CD45(3.99 ﹪),CD11b(0.63 ﹪)等造血细胞标志物(图 5).符合小鼠 MSC 的标准.

    4. 向成骨细胞诱导分化结果 :小鼠骨片 MSC经成骨诱导培养基诱导 2 周后,经碱性磷酸酶(ALP)染色提示细胞内有大量酶颗粒形成,与成骨细胞活性相关的碱性磷酸酶表达阳性(图 6).说明获得的细胞可以成功的诱导分化成骨细胞.
 

    5. 向脂肪细胞诱导分化结果 :获得的细胞经成脂诱导培养基诱导 4 ~ 5 d 后,倒置相差显微镜观察可见胞浆内出现圆形脂滴,并且随着诱导时间的延长,脂滴逐渐增多增大.诱导 2 周后,可见大多数细胞内充满脂滴.经脂肪细胞特异性油红O 染色,呈红色油滴样(图 7).证实获得的细胞可以成功诱导成脂肪细胞.

    讨 论

    MSC 因其具有分化潜能、免疫调控、分泌细胞因子等功能成为再生医学重要的种子细胞之一.目前已经被广泛用于多种疾病治疗的实验研究,包括移植物抗宿主病、糖尿病、脊髓损伤、肺和关节疾病等[9].小鼠因其品系纯,应用于科学研究中所获的实验结果敏感性高,一致性强,重复性高等优点,已被广泛应用于生物学、医学、兽医学、生理学、遗传学、胚胎发生学等领域的科学实验.小鼠还具有容易实现基因敲除[10]、体积小、繁殖快、经济等优点,作为动物模型越来越受到研究者的重视[11].研究者已经采用小鼠成功制作许多人类疾病的动物模型如糖尿病、卵巢癌、肥胖、白内障、创伤、甚至 HIV模型[12]等,为开展干细胞治疗疾病的实验研究提供了重要基础[11,13-15].然而研究者在采用传统方法分离小鼠骨髓 MSC 时却遇到了难题,很难成功的分离高纯度的 MSC,或者很难实现在体外长时间继代培养[7].一些研究者采用大鼠或人源的 MSC 作为供者细胞,替代小鼠来源 MSC来研究治疗效果,以解决小鼠 MSC 来源不足的问题.虽然 MSC 的免疫原性很低,但依然不能排除异种来源细胞对实验研究效果的影响.为避免上述问题对实验研究的影响,建立能获得足量、稳定的小鼠来源 MSC 对研究者具有重要意义.

    MSC 是骨髓腔中的基质细胞,是构成骨髓造血微环境的重要成分,因此骨实质中可能存在大量的 MSC[16].研究发现,在骨髓腔边缘或骨实质中还存在更原始的 MSC,表达成熟 MSC 不表达神经干细胞的标志[16].本研究通过清洗骨髓腔内骨髓,去除造血细胞的影响,成功从小鼠骨片中分离出高纯度的 MSC,并成功进行体外传代培养.获得的细胞高表达 MSC 标志 Scal1,CD29,CD90,不 表 达 造 血 系 统 细 胞 标 志 物 CD11b,CD34,CD45.并具有多向分化的能力,可以成功诱导成脂肪细胞、骨细胞.

    所以通过骨片法可以获得小鼠来源 MSC,并且纯度高,增殖能力更强,能够实现在体外较长时间的继代培养,为实验研究提供了很好的种子来源.同时还可以利用许多转基因小鼠如绿色荧光小鼠等,分离获得具有特殊功能的 MSC(表达绿色荧光),以及利用一些基因敲除小鼠获得某基因缺失的特殊 MSC,为进一步开展实验研究提供更丰富的种子来源.

    参 考 文 献:
    1 Friedenstein AJ, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J]. JEmbryol Exp Morphol, 1966, 16(3):381-390.
    2 Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblastprecursors in normal and irradiated mouse hematopoieticorgans [J]. Exp Hematol, 1976, 4(5):267-274.
    3 Kadiyala S, Young RG, Thiede MA, et al. Culture expandedcanine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenicpotential in vivo and in vitro [J]. Cell transplantation, 1997,6(2):125-134.
    4 Martin DR, Cox NR, Hathcock TL, et al. Isolation andcharacterization of multipotential mesenchymal stem cellsfrom feline bone marrow[J]. Exp Hematol, 2002, 30(8):879-886.
    5 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science, 1999, 284(5411):143-147.
    6 Wakitani S, Saito T, Caplan AI. Myogenic cells derivedfrom rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to5-azacytidine[J]. Muscle Nerve, 1995, 18(12):1417-1426.
    7 Phinney DG, Kopen G, Isaacson RL, et al. Plastic adherentstromal cells from the bone marrow of commonly usedstrains of inbred mice:variations in yield, growth, anddifferentiation[J]. J Cell Biochem, 1999, 72(4):570-585.
    8 陈津 , 郭子宽 , 王立生 , 等 . 大规模间充质干细胞培养技术评估 [J]. 中国医药生物技术 , 2013, 8(4):274-284.
    9 Sensebe L, Bourin P, Tarte K. Good manufacturingpractices production of mesenchymal stem/stromal cells[J].Hum Gene Ther, 2011, 22(1):19-26.
    10 Mcmurray F, Moir L, Cox RD. From mice to humans[J].Current diabetes reports, 2012, 12(6):651-658.
    11 Platt TL, Reeves VL, Murphy MP. Transgenic models ofAlzheimer's disease:better utilization of existing modelsthrough viral transgenesis[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1832(9):1437-1448.
    12 Dudek TE, No DC, Seung E, et al. Rapid evolution ofHIV-1 to functional CD8(+) T cell responses in humanizedBLT mice[J]. Sci Transl Med, 2012, 4(143):143ra98.
    13 Heymann MC, R?sen-Wolff A. Contribution of theinflammasomes to autoinflammatory diseases and recentmouse models as research tools[J]. Clin Immunol, 2013,147(3):175-184.
    14 Jungraithmayr W, Jang JH, Schrepfer S, et al. Small animalmodels of experimental obliterative bronchiolitis[J]. Am JRespir Cell Mol Biol, 2013, 48(6):675-684.
    15 Soler MJ, Riera M, Batlle D. New experimental models ofdiabetic nephropathy in mice models of type 2 diabetes:efforts to replicate human nephropathy[J]. Exp DiabetesRes, 2012:1-9.
    16 Mendez-Ferrer S, Michurina TV, Ferraro F, et al.Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a uniquebone marrow niche [J]. Nature, 2010, 466(7308):829-834.