DXD-1菌体细胞的凝聚性成因及初步研究方案

　　1、 DXD-1菌体细胞的凝聚性

　　在液体培养基中，DXD-1很容易出现菌体细胞的团聚现象，对于具有凝集性质的发酵菌体来说，凝集性使菌体能在发酵结束时迅速沉淀，可降低分离菌体所耗的能源，但同时菌团的形成在一定程度上也会阻碍氧气以及营养物质的运送，使得菌团内部的细胞处于缺氧以及营养不良的状态，从而影响菌体的生长和产物的合成。所以探讨DXD-1菌体细胞的凝聚性有利于优化菌体发酵合成代谢产物的能力，有利于进一步了解DXD-1菌体特性。

　　2、 菌体细胞凝聚的成因

　　很多真菌在摇瓶培养时都容易聚集成团，静置后沉淀下来，所呈现出的颜色和形状会随菌种、培养基成分、接种量、装液量、转速的不同而不同。这种现象是否与外界环境条件的变化影响菌体细胞分泌出一定的物质造成细胞集聚性的改变有关?菌体细胞自身如何影响其凝聚性?对于大多数真菌来说目前还未见与此有关的详尽报道。可以肯定的是菌体细胞凝集与细胞周质成分密不可分。当前与菌体细胞周质有关的研究主要集中在凝集素、絮凝性微生物和生物被膜方面。

　　2.1 凝集素

　　凝集素是一类能促使细胞凝集的糖蛋白，它与糖的非共价结合是专一的、可逆的。它广泛存在于自然界中，存在于各种动植物和微生物的细胞膜、细胞质和细胞外基质中。

　　2.1.1 凝集素的生物学效应

　　凝集素需要与凝集素受体特异性结合才能发挥其生物学效应。凝集素受体主要由糖蛋白组成，少数为糖脂或其他糖化物，一般位于细胞膜上。凝集素受体一旦与相应凝集素结合就会发生空间构型的变化．引起受体特性的改变，产生相应的生物学效应，如细胞凝集、贮存能量、抗病害、专一性识别等。

　　2.1.2 凝集素的提取分离工艺

　　目前凝集素以及凝集素单体的提取和分离纯化都是依照蛋白质的提前分离方法进行的，一般先将提取物经硫酸铵分级沉淀后，再用离子交换树脂或亲和色谱来纯化。李延清等用PBS缓冲液从马铃薯中提取凝集素粗提液。郭春生等采用生理盐水和磷酸缓冲液对芸豆浸提后用硫酸铵沉淀获得芸豆植物凝集素。袁燕等提取蒜头中的凝集素采用的是硫酸铵分段盐析法，而张涛等共沉淀红芸豆和甲状腺球蛋白的粗提取液后进行超滤可制备高纯度的红细胞凝集素，具有高效，高产品纯度和高活力的特点。

　　2.2 絮凝性微生物

　　微生物絮凝剂也属于微生物次生代谢产物中的一种，这种次生代谢产物具有絮凝活性。絮凝性微生物的菌体细胞自身通常能互相粘附形成絮状沉淀而达到分离的目的。酿酒酵母是典型的能使自身细胞发生凝聚的微生物，它的凝聚特性研究可以作为DXD-1 菌体的借鉴。

　　2.2.1 酿酒酵母的凝聚特性

　　酵母细胞凝聚的形式有3种：(1)酵母细胞芽殖时与母细胞连成细胞链形成凝聚。(2)酵母细胞有性繁殖时通过表面特殊的蛋白连接形成凝聚。(3)酵母细胞之间通过细胞壁上的特定蛋白与甘露糖残基的专一性结合形成的无性絮凝。该特定蛋白类似于外源凝集素，被称为“絮凝素”，编码絮凝素的基因称为絮凝基因。

　　2.2.2 酵母絮凝的影响因素

　　影响絮凝的因素除了菌株自身还有很多非遗传因素。如细胞壁成分、细胞表面特性、培养时间、接种量、营养成分、溶氧、温度、蛋白质变性剂、无机离子、细胞间相互作用力等。以往的研究结果表明，防止微生物絮凝在某些程度上能促进微生物的生长，原因是增加了游离细胞与培养液中营养物质的接触面积。絮凝不是微生物生命活动所必需的，有可能只是为了应对外界环境的变化而形成。

　　2.3 生物被膜

　　生物被膜是指菌体在繁殖、分化时由自身分泌的多糖基质及各种蛋白在细胞表面高度组织化系统化聚集所形成的膜样聚合物。目前研究较多的是细菌生物被膜和有害真菌的生物被膜。生物被膜是菌体在恶劣环境中形成的一种保护机制，被生物被膜包裹的菌体通常会因为营养物质的缺乏而生长缓慢。

　　2.3.1 生物被膜的鉴定

　　生物被膜的组成成分复杂且差异较大，常含有多糖基质、代谢产物及环境中特殊物质或碎屑等。细菌生物被膜的鉴定方法通常有试管法、银染法、扫描和透射电镜法、激光共聚焦扫描显微镜法和微量板定量检测法等，这些方法各有优缺点。

　　2.3.2 生物被膜的解离

　　生物被膜一旦形成就很难去除，生物被膜若发生解离通常有两种情况：(1)环境变化不利于微生物的生存，引发微生物的死亡。(2)环境变化更有利于微生物的快速生长。目前生物被膜的降解只有通过菌体自身产生的特异性降解酶来进行，还没有其它有效的人工方法。

　　3、 DXD-1菌体细胞凝聚的初步研究方案

　　在目前对细胞周质物质研究的基础上，初步确定研究DXD-1菌体细胞凝聚的方法如下：

　　3.1 确定菌体细胞絮凝成分的大致类型

　　对DXD-1菌体细胞周质成分进行分析，凝聚素多是糖蛋白，而生物被膜则多是成分复杂的混合物。可以先用几种简单的蛋白酶处理凝聚着的DXD-1菌体，如果菌体很容易分散则多是凝集素。如果凝聚程度没明显变化则进行生物被膜的分析方法。

　　3.2 形成生物被膜引起凝聚的研究方案

　　3.2.1 优化DXD-1菌体培养条件

　　如果絮凝原因是因为菌体形成了生物被膜，则证明培养条件可能不适宜菌体生长。鉴于生物被膜成分的复杂性，优化培养条件是解决絮凝因素的主要途径。

　　3.2.2 推测真菌生物被膜形成机制

　　现有的研究成果表明，在生物被膜内，菌体之间存在着信息传递。菌体分泌胞外复合物形成完整生物被膜结构是某些基因被信息分子活化的结果。探明这些基因的序列及影响表达调控的因素具有重要意义，对DXD-1进行分子生物学研究可以了解真菌生物被膜的形成机制。

　　3.2.3 有益菌生物被膜的进一步研究

　　微生物的生物被膜具有较强的抗逆性，能抑制金属腐蚀，能够产生抗菌物质，可以形成生物表面活性素保护植物免受病原菌侵害，作为污水处理中生物被膜反应器，研究生物被膜的开发和应用在现代工业和农业生产上有重要的意义。目前生物被膜的研究对象大多是有害菌，关于对有益菌的生物被膜的研究还很少见，DXD-1作为能产油脂的对环境友好的有益微生物，有望成为生产生物被膜的储备菌。

　　3.3 凝集素造成菌体凝聚的研究方案

　　(1)按凝集素的提取方法粗凝集素液，配制凝集素提取缓冲液浸泡离心后的菌体一段时间后再离心得到粗提液。将此粗提液采用透析方法浓缩后加入到分散的酵母细胞或动物红细胞中观察是否出现凝集反应。

　　(2)对该粗提液做糖抑制实验，该实验可考察与凝集素糖蛋白结合的糖的种类，从而可以推测出发酵培养过程不同碳源对菌体细胞凝聚的影响。

　　(3)对该粗提液进行成分分析。SDS-PAGE电泳分析凝集素的分子量，并用色谱或质谱技术分析蛋白质和糖的种类，以确定凝集素成分。

　　(4)利用基因工程的手段参照已有的酵母絮凝基因研究方法构建DXD-1絮凝基因组文库. 从文库中筛选重组子获得表达絮凝活性的克隆子，并进行序列分析得到DXD-1的絮凝基因。

　　(5)对所获得的DXD-1絮凝基因进行遗传改造，使絮凝基因失活或控制絮凝基因只在发酵结束时表达，而不在发酵的早期及中期表达。

　　实验室已有的研究表明DXD-1是一株高产油真菌，具有工业化生产的潜力。其凝聚特性在一定程度上阻碍了发酵的进行。鉴于目前酿酒酵母絮凝特性的研究和在工业上的应用，有望解决DXD-1在发酵过程中絮凝的缺点，并借助基因工程的手段赋予DXD-1在发酵后期表达诱导型絮凝基因的能力，以方便在工业化生产发酵后期菌体的分离和回收利用。

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