细胞生物学论文
随着现代神经科学及分子生物学的发展，在多个研究领域中原代大鼠大脑皮层神经细胞的培养日益被广泛应用，不仅促进了对神经元结构和功能的进一步了解，还为大脑神经系统疾病发病机制研究及药物的作用机制研究提供了一个平台。但在具体的实验操作中，胎鼠大脑皮层神经元的分离和体外培养方面仍然存在一系列问题，如胎鼠胎龄难以控制，新生鼠进行神经元培养时细胞存活率较低，细胞数量少、细胞损伤大及神经元纯度欠佳等，严重限制了后续研究的进行。因此，本研究在参照相关文献[1-5]及反复实验的基础上，对细胞消化及重悬细胞等步骤进行了适当改进，得到了较理想的培养结果。详情如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
将适龄的Wistar大鼠（吉大医学部实验动物中心提供）雌雄各一只合笼过夜，次日观察，以见到阴栓开始将该雌鼠单独饲养并计算时间。以24h为1d,至第16d时可用于实验。
1.1.2实验试剂及溶液的配制
多聚赖氨酸（分子量70,000-150,000）购自美国Sigma公司。
L-谷氨酰胺（200mM 100X）、DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司。细胞爬片（24孔）购自alafa公司。胎牛血清购自四季青公司。
B27、Neurobasal神经元专用培养液、兔抗大鼠一抗、山羊抗兔荧光二抗购自美国life公司。
PBS缓冲液pH调至7.3-7.4,高压灭菌，4℃保存。PDL包被液：用三蒸水配制1mg/ml的PDL储液，微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。含血清培养液：87%Neurobasal+2%B27（50×）+1%L-glutamine（200mmol/L）+10%胎牛血清，混匀，4℃保存。无血清培养液：97%Neurobasal+2%B27（50×）+1%L-glutamine（200mmol/L）,混匀，4℃保存备用。
1.1.3培养板及爬片的预处理
用0.1mmol/ml的多聚赖氨酸，分别包被12孔培养板及24孔爬片（用于神经元鉴定）。37℃孵育箱内放置过夜。多聚赖氨酸预处理24h后将液体吸出，自然干燥后，无菌超纯水冲洗2遍，置超净台内备用（避光保存）。
1.2方法
1.2.1神经元体外培养
取1只孕第16-18d的Wistar大鼠，脱锥处死并固定，75%酒精局部消毒腹部，开腹，分离子宫并消毒，迅速穿破羊水取出胎鼠，去除胎盘，将胎鼠置于预冷的PBS溶液内并转移至超净台，无菌条件下用尖镊剥去硬脑膜，暴露两侧大脑半球，取出大脑，转移至DMEM溶液中继续剥软脑膜，分离出皮层，用PBS平衡盐溶液清洗2遍，剪成1mm3或更小碎块；加胰酶，37℃消化10min,每隔3min轻轻摇晃1次，用抛光过的移液管吸取上清，再对剩余组织进行2次消化10min,吸取上清至等体积DMEM+10%胎牛血清+1‰双抗中，均匀抽吸20-25次，终止消化，70μm尼龙网筛过滤杂质，室温800r/min离心5min,弃上清，加入含10%血清的Neurobasal培养液重悬。细胞计数后以9.0×105-1.0×106个/ml的密度将细胞接种至预先处理过的孔板内，12孔板1ml/孔，24孔板0.5mL/孔，5%CO2、37℃孵箱孵育，4-5h后用无血清Neurobasal培养基全量换液。体外培养第3d以终浓度5μmol/L的阿糖胞苷（抑制胶质细胞生长）作用24h后换液。此后每3d换液1次，体外培养第7-12d的细胞用于实验。
1.2.2形态学观察及鉴定
细胞种板后，定期在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况并记录。神经元鉴定：细胞种板的第5d,在长满细胞的爬片上加入预冷4%的多聚甲醛，300μl/孔，4℃固定细胞15min,沿一边吸去多聚甲醛，注意不要碰到细胞，PBS洗3次，每次5min.用0.5%TritonX-100对细胞进行通透，时间为15min,然后加入封闭液（10%胎牛血清）室温封闭1h.小心取出爬片，放在自制板上，一抗（1%胎牛血清1∶1 000稀释）200μl/片，垂直加，把爬片铺满，放入小盒中，底部放PBS保持湿度，37℃2h,PBS清洗2次，加入二抗（1%胎牛血清1稀释），室温避光孵育45min-1h.PBS洗1次，室温下加入33258核染色5min,在载玻片上用50%丙三醇封片，荧光显微镜下观察。随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取平均值作为神经元阳性率。
2 结果
2.1神经元纯度鉴定
免疫荧光结果显示，神经细胞占的比例较高，突起走形正常，形态符合神经元的基本特征，核大而清晰，阳性率达90%以上。
2.2倒置相差显微镜观察
观察刚种板的神经细胞，分布均匀，呈圆形，无色透明，折光性较强（图1）;1d后神经元已全部贴壁，细胞数量较多，细胞周边有光晕，部分细胞呈梭形，有伸长的突起，但细胞间连接较少（图2）;3d后细胞形态比较典型：胞体饱满，大多数细胞呈梭形，少数为多边形，突触之间相互连接，可见少数神经胶质细胞（图3）;4d加完阿糖胞苷后，背景中几乎不见扁平多边形的胶质细胞，神经元胞体逐渐增大，突起进一步延伸并连接成网（图4）；第7d,原方法培养的细胞中有部分存活的细胞，但胞体逐渐缩小聚集，突起缩短，细胞抱团，状态不能用于实验（图5）;而用改进后方法培养的细胞，形态良好，连接紧密，分布均匀，可用于实验（图6）。3讨论大多 数文献报道[6-8],在消化细 胞时，通 常 用0.25%Trypsin对大脑皮层组织进行一次消化（20min），但经过前期的探索研究发现用该法消化得到的细胞损失较大，存活力低，最终达不到实验要求。
其 原因可能是Trypsin消化细胞时，先分离下来的细胞易消化过度，最终导致细胞损伤或死亡。经过改进后，本实验采用2次消化法分离，对细胞损伤更小且获得的细胞更多。
国内外有关皮质神经元取材公认的是采用胚胎大鼠作为神经细胞培养组织来源的种属[9],因为在大鼠胚胎发育16-18d时细胞正处于分裂时期、繁殖阶段，取此时的神经元进行培养，存活的细胞数相对就较多，利用此阶段的大鼠胚胎提取神经元可以提高细胞的成活率并能较好地控制杂质细胞的百分含量。但在实际应用中却较多采用新生鼠培养神经元，因为使用胎鼠难以精确控制胎龄以致费用较高、取材困难等缺点。在本研究中我们采用单独合笼，观察阴栓的方法建立了1种低成本并简便易行的获得胎鼠以培养神经元的方法。
目前多数文献报道[10-12]在接种细胞时用加血清的DMEM重悬细胞，12h后才全量换成神经元培养基，实验发现这样不利于神经元生长，换液间隔时间太长，会导致胶质细胞生长过多，细胞纯度降低。在本实验中，我们用含血清的神经元培养液种板，在接种细胞4-5h时换成无血清培养液培养。胎牛血清能促进神经细胞贴壁，大脑皮层神经细胞种板5h后细胞大部分已经贴壁牢固而细胞碎片还没有贴壁完全，此时换液能去除细胞碎片及还未贴壁的胶质细胞[13].大脑皮层神经元接种超过12h后，细胞碎片已经贴壁牢固，直接影响神经元的存活，并且胶质细胞已经贴壁生长，所以换培养液时间为4-5h最适宜。
本研究对神经元培养过程中获取孕鼠，细胞消化以及培养液等方面进行了改良。在采用此方法以后，无论是在神经元的数量及纯度上，或是生长状态上，都有较大的进步，这对以原代培养神经元作为实验对象的研究而言尤为重要。