破骨细胞中p62/SQS下M1的信号传导通路及相关骨骼疾病

　　在人体正常的骨骼组织中，成骨细胞和破骨细胞通过调节骨形成与骨吸收共同维持骨骼的动态平衡；而骨质疏松的发生则是骨吸收和骨形成过程中的动态平衡被打破，使得骨组织结构和力学特征发生改变。目前的研究表明，p 62/SQSTM 1 通过调控破骨细胞的信号传导通路，在骨代谢的调节及骨质疏松的形成中发挥重要的作用。

　　1 p62/SQSTM1的概述及其作用机制。

　　1.1 概述 人类的 p 62 基因位于 5 号染色体上，包含 8个外显子，编码含有 440 个氨基酸残基的 p 62 蛋白。Shin J 等[1]在 p 62 蛋白作用机制的研究中，注意到 p 62 参与形成细胞内多泛素化蛋白质聚集体，据此将 p 62 蛋白命名为 sequestosome 1.

　　p 62/SQSTM 1 是一个由 SQSTM 1 编码的多功能泛素结合蛋白，它的一级结构序列中至少包含 9 个带有结构性模体（motif）的结构域，可与其它蛋白质相互作用。这些结构域包括：N 末端的 PB 1 结构域，结合 aPKC、ERK、NBR 1、MAPKK 5（MEK 5）等，也能与 p 62 自身结合；1 个 ZZ 型锌指结构，可与 RIP 相互作用；1 个与肿瘤坏死因子受体相关因子 6（TRAF 6）结合的结构域（TRAF 6-binding domain,TBS）；1 个核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）模体；1 段与微管相关蛋白 1 轻链 3（LC 3）相互作用的 LC 3 作用域（LIR）；2 个位于 LIR 两侧的 PEST 序列；1 段与 Keap 1（Kelch-like ECH-associated protein 1）结合的Keap 1 作用区域（KIR）；1 个与 p 38 蛋白结合的结构域和 C 末端的泛素相关结构域（UBA）[2].

　　1.2 作用机制 p 62 作为一种信号转导途径中的支架和适配子蛋白，是细胞内多种蛋白复合物的主要成分。其多个结构域与其它蛋白质相互作用，介导多种细胞功能，包括细胞信号转导、受体内化、蛋白更新和基因转录调控等[3].Morissette J,Laurin N[4]等的研究认为 p 62 在骨的生理调控中具有重要的作用。而p 62最明确的功能是其作为细胞内信号转导和NF-B选择性活化的支架蛋白[5].P 62 作为一个穿梭因素，不论是在靶向泛素化的蛋白质降解还是在自体吞噬或蛋白酶体途径都扮演着重要的角色[6-7].此外，与众多的蛋白质相互作用，P 62 被认为是RANKL 激活信号传播的交换机，从而在破骨细胞起重要的作用[8].

　　2 破骨细胞中p62/SQSTM1的信号传导通路。

　　2.1 P 62 介导 NF-κB 的激活，促进破骨细胞的形成及活化 连接 RANKL 与 TRAF 6 介导 NF-κB 激活是 P 62 支架蛋白的功能之一[9].P 62 蛋白支架在 RANK 诱导信号中通过聚集和形成信号复合物，与其结合并激活 TRAF 6 发挥着重要的作用[10].RANKL 与其受体 RANK 的结合导致 TRAF 6 聚集；而后 TRAF 6 通过激活 IB 激酶（IKK）复合体来使 NF-κB活化[11].而 p 62 与 TRAF 6 结合后，P 62-TRAF 6 复合体将与非典型蛋白激酶 C（aPKC）蛋白相互作用，通过 IB 激酶 B 的磷酸化（IKKb）调节 NF-κB 的活化[10,12-13].此外，TRAF 6 也和TGFB 激活的蛋白激酶 （1TAK 1）及接头蛋白 TAB 1、TAB 2形成复合物[14].当 TAK 1 被激活时，它反过来磷酸化 NF-κB诱导激酶（NIK），激活 IKK 复合物，使 NF-κB 通路活化[15-16].

　　Liu W,Xu D 等[17]的研究显示 3 个 RANK-TRAF 结合基序参与了破骨细胞的形成和活化。此外，Shinohara M,Wada T 等[18-19]的研究也证实上述信号分子促进破骨细胞分化，存活和活动。

　　2.2 P62与CYLD作用，负调节破骨细胞 p 62 作为一个接头蛋白，能与 CYLD 相互作用，促进 CYLD 与 TRAF 6 的结合，增加 CYLD 对 TRAF 6 分子的去泛素化作用[20].CYLD 通过降低 TRAF 6 自身泛素化负调控 NF-κB 的活性[21-22].而Kovalenko A[23]

　　等通过泛素化实验进一步证实 CYLD 通过抑制 NEMO、TRAF 2、TRAF 6 分子的泛素化，从而抑制 NF-κB信号通路的活性。CYLD 负调节 IKK 和 JNK 的活化，并且在RANKL 诱导的破骨细胞形成的条件下显着上调它的表达[24].因此，CYLD 似乎是 RANK 在破骨细胞的信号通路中的一个关键的负调节点。此外，Jin W,Chang M 等[24]的实验还证实，由于CYLD 缺陷型小鼠对 RANKL 过度敏感，表现出严重的骨质疏松症与异常的破骨细胞分及更大更多的破骨细胞。

　　2.3 P 62 调控 NFATc 1 和 ERK,调节破骨细胞的分化 RANKL 特异且强烈地诱导 T 细胞核因子（NFATc 1 的或NFAT 2）的活化，它是破骨细胞分化的主要调节器[25].这种诱导与 TRAF 6、c-Fos 等通路有关。而 TRAF 6 的活性是受 p 62 交互影响的，因此，p 62 在某种程度上间接控制 NFATc 1 的信号。

　　在 RANKL 存在时，NFATc 1 的表达升高，并引起破骨细胞的终末分化；NFATc 1 与 c 2Fos 协同促进了诸如 TRAP 和降钙素受体等破骨细胞特异性基因的表达[26].Takayanagi H[27]等在体外使用胚胎干细胞的破骨细胞分化实验中发现 NFATc 1 缺失的细胞表现出破骨细胞生成的缺陷。而 Matsuo K 等[28]的报告还进一步指出一种活性形式的 NFAT 可以重建在 Fos 缺陷细胞中观察到的破骨细胞生成的损伤。由此可知，NFATc 1 在RANK 信号传导引起破骨细胞分化的过程中起着重要的作用。

　　此外，Ang ES 等[29]的研究显示 RANKL 也诱导有助于破骨细胞分化和存活的 MEK/ERK 通路。而 P 62 在 NF-κB、NFAT 的活化及 ERK 的磷酸化中起着重要作用[30].

　　2.4 P 62 和破骨细胞中 PDK 1/aPKC 的活化 DuranA 等[31]有关小鼠实验模型的研究指出：对 RANKL 的刺激可诱导 TRAF 6、P 62 和非典型 PKCS（aPKCs）之间形成三元复合物，并认为 p 62 是破骨细胞形成中的一个重要因素。与此结果1PKCζ、P-PKCζ/λ 及 P-PDK 1 与 P 62 有关联[32].根据对PKCζ 的了解，像其他 aPKCs 一样，是 PDK 1 的基板，表明了PDK 1 在 P 62-aPKC 信号通路中的作用，但也许还有其他的TRAF 6-P 62 信号通路。事实上，PDK 1 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是公认的调控多种细胞信号传导通路的主蛋白激酶，并且可以通过酪氨酸磷酸化（Tyr 9 和 Tyr 373/376）进一步激活。PDK 1 也被发现具有磷酸化，通过 cAMP、cGMP 依赖蛋级白激酶 C 激酶家族中的蛋白质包括新的和非典型 PKCS,p 70 S 6K等的激活其他成员[33].

　　3 与p62/SQSTM1相关骨骼疾病。

　　3.1 骨质疏松 众所周知，骨质疏松是由成骨细胞与破骨细胞失稳态所引起的骨骼疾病。研究表明，成骨细胞可参与破骨细胞的分化和激活，而这些过程是由两个信号通路：一个通过M-CSF 及 NF-κB 配体（RANKL）的受体激活剂激活；一个由 ITAM 介导的共刺激信号[34].RANKL 是由成骨细胞、基质细胞和活化的淋巴细胞表达的能与膜结合的 TNF 相关因子，其主要与破骨细胞表面的特异性受体 RANK 结合，进而刺激破骨细胞分化、活化和成熟，同时抑制破骨细胞凋亡。目前的研究已证实p 62 参与了 NF-κB 的激活。因此，p 62/SQSTM 1 通过参与的信号传导通路激活破骨细胞，与骨质疏松的发生及形成密切相关。

　　3.2 Paget 骨病 Paget 骨病（PDB）是以骨更新异常为主要特征的人类慢性代谢性骨骼疾病，它主要表现为：骨无序代谢增加和破骨细胞过度活跃。Cundy T,Naot D 等[35]的报告指出40%的家族性或偶发 PDB 病例被检测出 p 62 突变体。而 SarahL Rea 等[36]的报告更是显示：到目前为止，已有 28 个 PDB 相关的 p 62 突变体被发现。许多 PDB 突变体位于 p 62 的 UBA 结构域，UBA 结构域的突变导致 p 62 与泛素化的 TRAF 6 的相互作用受损，或 p 62 与泛素化的 TRAF 6 的去泛素化酶 CYLD 的相互作用受损，进一步促进 RANKL 刺激 NF-κB 的激活，结果造成破骨细胞生成量增加[37-38].进而导致 Paget 骨病的发生。

　　4 结语与展望。

　　p 62/SQSTM 1 通过介导 NF-κB 的激活、NFATc 1 和ERK 的调控等信号通路，促进破骨细胞的激活及分化，在骨质疏松、Paget 骨病等相关骨骼疾病的发生及发展中起重要的作用。任何直接或间接调节 p 62 的机制，其对破骨细胞活化的重要性是毋庸置疑的；但 p 62 在破骨细胞中影响的确切机制仍有待充分确定。然而，p 62/SQSTM 1 作为一个多功能蛋白分子，其结构中的多个特殊功能结构域可与其它蛋白质相互作用，显示出p 62 蛋白的多功能特征及调节机制的多样性。因此，进一步研究和探讨 p 62 复杂而严密的调控机制，能帮助我们更深入地认识骨质疏松、Paget 骨病等相关骨骼疾病的生理和病理机制，从而为相关骨骼疾病的防治提供新的思路及方向。

　　参考文献。

　　[1] Shin J.P 62 and the sequestosome,a novel mechanism for proteinmetabolism[J].Arch Pharm Res,1998,21（6）：629-633.

　　[2] Lin X,Li S,Zhao Y,et al.Interaction domains of p 62:a bridge betweenp 62 and selective autophagy[J].DNA Cell Biol,2013,32（5）：220-227.

　　[3] Moscat J,Diaz-Meco MT,Wooten MW.Signal integration and diversificationthrough the p 62 scaffold protein[J].Trends Biochem Sci,2007,32:95-100.

　　[4] Morissette J,Laurin N,Brown JP.Sequestosome 1:mutationfrequencies,haplotypes,and phenotypes in familial Paget's disease ofbone[J].J Bone Miner Res,2006,21（Suppl 2）：38-44.

　　[5] Geetha T,Wooten MW.Structure and functional properties of the ubiquitinbinding protein p 62[J].FEBS Lett,2002,512:19-24.

　　[6] Hocking LJ,Mellis DJ,McCabe PS,et al.Functional interactionbetween sequestosome-1/p 62 and autophagy-linked FYVE containingprotein WDFY 3 in human osteoclasts[J].Biochem Biophys ResCommun,2010,402:543-548.

　　[7] Seibenhener ML,Geetha T,Wooten MW.Sequestosome 1/p 62?more thanjust a scaffold[J].FEBS Lett,2007,581:175-179.

　　[8] McManus S,Roux S.The adaptor protein p 62/SQSTM 1 in osteoclastsignaling pathways[J].J Mol Signal,2012,7:1.