神经干细胞增殖中非必需氨基酸与β-巯基乙醇的作用研究

　　神经干细胞（ NSCs） 广泛存在于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的前体细胞，它可以通过对称分裂和不对称分裂方式进行自我更新并产生神经组织的各类细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等[1].NSCs 的发现为神经系统变性、损伤性疾病的修复、治疗开辟了新途径。已有研究表明，非必需氨基酸（ NEAA） 和 β-巯基乙醇能够促进小鼠胚胎干细胞向 NSCs 转化[2],但目前尚无 NEAA 和 β-巯基乙醇对孕 14. 5 d 来源胎鼠的 NSCs 作用的相关报道。本文进行了相关探讨。

　　1 材料与方法。

　　1. 1 材料 实验动物： 孕 14. 5 d 雌鼠购于昆明医科大学实验动物中心，合格证号： SCXY（ 滇） -2014004.试剂： 达尔伯克改良伊格尔培养基-F12 营养混合物（ DMEM-F12） 培养基，神经基础培养基（ NeuronalBase） ,NEAA,β-巯基乙醇，青 / 链霉素（ P / S） ,谷氨酸混合物，0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ Trypsin-ED-TA） ,胎牛血清（ FBS） ,牛血清蛋白（ BSA） 均购自 Gib-co 公司。B27,噻唑蓝（ MTT） 购自 Sigma 公司。表皮细胞生长因子（ EGF） ,碱性纤维生长因子（ bFGF） ,巢蛋白（ Nestin） ,神经元Ⅲ类 β 微管蛋白（ TUJ-1） ,胶质纤维酸性蛋白（ GFAP） 购自 Millipore 公司。PCR 逆转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，其他 RT-PCR试剂购自 ABI 公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ GAPDH）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（ Caspase-3）基因引物由 Invitrogen 公司合成。GAPDH: F:5'-GCT-TCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'; R: 5'-TTGGCTC-CACCCTTCAAGTG-3'. Caspase-3: F: 5'-ACCGAT-GTCGATGCAGCTAA-3'; R: 5'-GGTGCGGTAGAGTA-AGCATA-3'.

　　1. 2 培养基的配制 NSCs 原代培养基： 向 DMEM /F12 培养基内加入 2 mmol / L Gluta MAX,2 mmol / LP / S,4 mmol / L B27,20 ng / mL EGF 和 20 ng / mLbFGF.NSCs 传代培养不含 P / S,其余与原代培养基相同。NSCs 贴壁培养基： 向 DMEM/F12 培养基内加入 50% Neuronal Base、1% BSA、2 mmol/L GlutaMAX、4 mmol / L B27、20 ng / mL EGF 和 20 ng / mLbFGF.NSCs 分化培养基： 向 DMEM / F12 培养基内加入 50% Neuronal Base、0. 5 % FBS、2 mmol/L Glu-ta MAX、4 mmol / L B27.

　　1. 3 小鼠 NSCs 的分离和培养 取孕龄为 14. 5 d的雌鼠，三溴乙醇安乐死后无菌操作取出胎鼠前脑的侧脑室颗粒下层（ SVZ） ,剪碎，使用 400 μL 的0. 05% Trypsin-EDTA 于 37 ℃ 消化 10 min,每 5 分钟吹打 1 次，使用 DMEM-F12 培养基终止消化。将细胞悬液在12 000 g、4 ℃离心10 min,弃上清，使用1 mL NSCs 原代培养基重悬细胞后将 NSCs 种于 12孔板。体外培养 7 d,NSCs 会形成生长成熟的神经球，将生长成熟的神经球进行传代。具体操作： 将神经球吸入到 1. 5 mL 离心管，800 g、4 ℃离心 5 min,弃上清，使用 400 μL 胰酶消化 3 min,使用 DMEM-F12 培养基终止消化。将细胞悬液在 800 g、4 ℃ 离心 5 min,弃上清，使用 NSCs 传代培养基重悬细胞，细胞计数，以 2 ×105/ 孔将 NSCs 种于 12 孔板，每孔含传代培养基 1 mL.传代的 NSCs 在体外培养 3 d会形成成熟的神经球，继续将神经球传代。5 ~7 代NSCs 用于本实验。

　　1. 4 分组及 NSCs 的处理 NSCs 传代后以 2 × 105/ 孔种于12 孔板，分为四组，对照组： 加入磷酸盐缓冲液（ PBS） 12 μL; NEAA 组： 加入 NEAA 10 μL,PBS 2 μL;β-巯基乙醇组： 加入 β-巯基乙醇 2 μL,PBS 10 μL;NEAA + β-巯基乙醇组： 加入 NEAA 10 μL,β-巯基乙醇2 μL.NEAA 浓度为 1% ,β-巯基乙醇浓度为 0. 1mmol / L.NSCs 以 1. 0 × 105/ 孔 种 于 多 聚 鸟 氨 酸（ 0.01%） 包被过的24 孔板，每孔加入0.5 mL NSCs 贴壁培养基，体外培养48 h,进行免疫组化染色，对 NSCs鉴定。本试验所用细胞为传代5 ~7 代的 NSCs,所有细胞能染色 Nestin,提示我们所用细胞为 NSCs.

　　1. 5 NSCs 增殖速度的测算 用于实验的 NSCs 使用传代培养基以 2 ×105/ 孔种于 12 孔板，按分组给予处理（ 同 1. 4） ,并悬浮培养。48 h 后收集神经球，吹散，消化后使用血细胞计数器进行活细胞计数。增殖速度 =48 h 后收集的活细胞数/2 ×105.

　　1. 6 NSCs 增殖率的测算 采用 MTT 法。NSCs 以0. 1×105/ 孔种于多聚鸟氨酸（ 0. 01% ） 包被过的 96 孔板，每孔加入0.2 mL NSCs 贴壁培养基并按分组给予处理（ 同1.4） ,体外培养48 h,加入 5 mg/mL 的 MTT 在 37℃作用 4 h,去除培养基，加入二甲基亚砜 150 μL / 孔，室温下摇床上孵育15 min,使用酶标仪（ Turner BioSys-tems 公司） 450 nm 测定吸光度（ A 值） .

　　1. 7 NSCs 中 Caspase-3 mRNA 的检测 采用 RT-PCR 法。用于实验的 NSCs 使用传代培养基培养，并进行分组及处理（ 同 1. 4） .48 h 后收集神经球，加入总 RNA 抽提试剂，提取总 RNA.其余步骤按试剂盒说明书进行。

　　1. 8 GFAP、Nestin 阳性细胞数的测算 采用免疫组化染色法。NSCs 以 0. 5 × 105/ 孔种于 多聚 鸟 氨 酸（ 0.01%） 包被过的24 孔板，每孔加入0.5 mL NSCs 分化培养基，体外培养 7 d,进行免疫组化染色（ TUJ-1、Nestin、GFAP） ,对 NSCs 向神经元和星形胶质细胞分化比例进行测定。具体步骤按试剂盒说明操作，镜下观察，拍片。Image J 软件计算阳性细胞所占百分比。

　　1. 9 统计学方法 采用 SPSS17. 0 统计软件。计量资料以珋x ± s 表示，多组间比较用单因素方差分析。P < 0. 05 为差异有统计学意义。

　　2 结果。

　　各组 NSCs 增殖速度、细胞增殖率、Caspase-3mRNA、TUJ-1 阳性细胞、GFAP 阳性细胞、Nestin 阳性细胞比较见表 1.

　　3 讨论。

　　近年随着我国人口的迅速老龄化，中枢神经系统退行性疾病日益增多。虽然目前已有研究报道利用 NSCs 移植治疗阿尔茨海默病、亨廷顿病、多发性硬化、中风、脊髓损伤等神经退行性疾病[3,4],但是NSCs 移植治疗始终存在免疫排斥[5]和伦理学的挑战。1992 年 Reynolds 等[6]从成年鼠的纹状体和海马中分离出 NSCs,确定在成熟的中枢神经系统有NSCs 的存在。神经损伤后，通过内源性及外源性刺激，促进神经新生，即促进机体自身的 NSCs 增殖、分化以修复受损的组织是 NSCs 研究的主要目的[7].寻找安全有效的药物来促进自体神经新生一直是 NSCs 研究者努力的方向。

　　本研究中我们选择孕 14. 5 d 的雌鼠，提取其胎鼠的前脑 SVZ 区经胰酶消化后获得 NSCs 进行培养。如果雌鼠的孕期短于14 d,其胎鼠的脑发育差，脑体积小，脑组织不饱满，完整地提取胎鼠前脑的实验操作难度加大。更重要的是，由于发育时间短，胎龄过小的胎鼠脑提取出的 NSCs 数量少、质量差，难以长期传代。如果胎龄大于 15 d,NSCs 已经开始向神经元发育，NSCs 的增殖能力差会影响实验结果，造成较大实验偏差。细胞活性的高低可以反映细胞的增殖能力[8].细胞增殖速度是衡量细胞增殖的另一项常用指标。

　　本研究中 NEAA + β-巯基乙醇组细胞增殖率及增殖速度最高，NEAA 组及 β-巯基乙醇组高于对照组。说明 NEAA 和 β-巯基乙醇均具有促进 NSCs 增殖的作用，联合作用效果更佳。Caspase-3 是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶[9],其裂解活化直接导致细胞 死 亡[10].本 研 究 发 现，1% NEAA 和 0. 1mmol / L β-巯基乙醇均可降低 Caspase-3 mRNA 表达，联合作用效果更强。提示 NEAA 和 β-巯基乙醇均具有抑制 NSCs 细胞凋亡的作用。本研究中的 β-巯基乙醇组及 NEAA + β-巯基乙醇组 TUJ-1、GFAP阳性细胞百分比均降低，Nestin 阳性细胞百分比升高，以 NEAA + β-巯基乙醇组为着，提示 β-巯基乙醇具有抑制 NSCs 向神经元及星形胶质细胞分化的作用，以联合应用效果更佳。（表略）

　　参考文献：

　　[1]Guo W,Patzlaff NE,Jobe EM,et al. Isolation of multipotent neu-ral stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subven-tricular zone of a single adult mouse[J]. Nat Protoc,2012,7（ 11） : 2005-2012.

　　[2]Freitas-Correa L,Lourenco MV,Acquarone M,et al. 2,4-Dinitro-phenol induces neural differentiation of murine embryonic stemcells[J]. Stem Cell Res,2013,11（ 3） : 1407-1416.

　　[3]Hedayatpour A,Ragerdi I,Pasbakhsh P,et al. Promotion of remyeli-nation by adipose mesenchymal stem cell transplantation in a cuprizonemodel of multiple sclerosis[J]. Cell J,2013,15（ 2） : 142-151.

　　[4]Greenberg ML,Weinger JG,Matheu MP,et al. Two-photon ima-ging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural pre-cursor cells in a viral model of multiple sclerosis[J]. Proc NatlAcad Sci USA,2014,111（ 22） : E2349-E2355.