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高氧对肺损伤患儿的影响研究

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2016-03-04 共2682字
摘要

  近年随着科技的进步,越来越多的极度早产儿和极低出生体质量儿幸存下来,但是由于长期吸入高浓度氧,患儿可发生肺损伤,严重者甚至发生支气管肺发育不良( BPD)[1,2].目前,高氧性肺损伤的机制尚不清楚,最近研究的热点主要集中在氧化应激方面[3,4],而 NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶( SIRT1) 在氧化应激及 DNA 损伤修复中发挥重要作用[5].本研究在前期实验基础上,通过建立高氧损伤人肺泡上皮细胞( HPAEC) 模型[6],探讨 SIRT1转位是否介导肺泡上皮细胞发生凋亡,从而为减轻高氧肺损伤寻找新的治疗靶点。

  1 材料与方法。

  1. 1 细胞、仪器及试剂 HPAEC 细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司。LX71 型倒置相差显微镜购自 Olympus 公司,FORMA311 型 CO2培养箱、胎牛血 清、DMEM 高 糖 培 养 基 购 自 Gibco 公 司,ANNEXIN V流式细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司,单克隆小鼠抗 SIRT1 抗体购自博士德生物公司,罗丹明标记山羊抗小鼠 IgG 购自 ZSGB-BIO公司,DAPI 购自碧云天生物公司,抗荧光淬灭封片液购自碧云天生物公司,单克隆小鼠抗 SENP1 抗体与单克隆抗乙酰化 p53lys( 382) 抗体购自 Abcam 公司,ECL 化学发光试剂购自北京普利莱基因技术有限公司。

  l. 2 HPAEC 细胞培养 先将 HPAEC 细胞复苏,加入含有 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养液,放入37 ℃ 、含 5% CO2培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时,用 0. 25% 的胰蛋白酶进行消化,传代培养。

  1. 3 HPAEC 细胞分组及高氧干预 取对数生长期的细胞,消化后传代接种于培养瓶中,随机分为高氧组、对照组。对照组不作处理,放置于 50 mL/L CO2培养箱中培养; 高氧组换液 1 次后,以 3 L/min 的速度通入含 900 ml/L O2和 50 mL/L CO2高纯混合气,通入时间为10 min,参照我们前期高氧模型建立的方法[6].分别培养 24 h( 高氧组细胞干预 24 h后,使用测氧仪检测培养瓶中氧浓度,如果氧浓度 <90% 则弃去该标本) ,之后收集 HPAEC 细胞。

  1. 4 HPAEC 细胞凋亡情况观察 两组细胞培养24 h后,收集细胞,用流式细胞仪检测,按照凯基ANNEXIN V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。

  1. 5 HPAEC 细胞形态学观察 倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,并照相。

  1. 6 HPAEC 细胞 SIRT1 蛋白转位情况观察 将HPAEC 细胞消化后,按细胞密度为 2 × 104/ 孔接种于 6 孔板中盖玻片上培养,同步化细胞,两组均加入1 mL 培养基,高氧组另通入高浓度氧,分别培养24 h; 多聚甲醛固定细胞 10 min; 0. 3% Triton X-100打孔10 min; 5%封闭血清在37 ℃封闭30 min; 将稀释的抗体 SIRT1( 终浓度为 1∶ 100) 滴加在细胞爬片上,4 ℃冰箱孵育过夜,在避光情况下将罗丹明标记的山羊抗小鼠 IgG( 终浓度为 1∶ 50) ,37 ℃湿盒中孵育 60 min; 用 PBS 洗涤 3 次,滴加 DAPI 复染,免疫共聚焦显微镜下观察并照相; 每张细胞爬片截取 5个视野,每组 8 张爬片,并照相,计算细胞转位率。

  1. 7 HPAEC 细胞 SENP1、乙酰化 p53 蛋白检测采用 Western blotting 法。两组细胞培养干预 24 h( 细胞生长 80%融合) ,胰酶消化后 PBS 冲洗,离心并移 去 上 清。加 入 200 μL 裂 解 混 合 液,冰 浴30 min,离心取上清,电泳、转膜,加入一抗,再加入显色的二抗,以 TBST 清洗,使用 ECL 进行结果的显影,然后用 Labworks4. 6 分析目的条带的灰度值。

  1. 8 统计学方法 采用 SPSS17. 0 统计软件。计量资料以x ± s 表示,组间比较采用 t 检验; 计数资料比较采用 χ2检验。P <0. 05 为差异有统计学意义。

  2 结果。

  高氧组和对照组细胞凋亡率分别为 24. 77% ±2. 17% 、5. 33% ± 2. 60% ,两组比较,P < 0. 05.高氧组细胞从正常的长梭形、多角形变成圆形、椭圆形,细胞间的间隙增宽,悬浮的细胞较多; 对照组细胞大多为长梭形、多角形,贴壁较好,细胞间的间隙较小,悬浮的细胞较少。高氧组和对照组细胞 SIRT1 蛋白转位率分别为 88. 89% ( 96/108) 、16. 23% ( 25/154) ,两组比较,P < 0. 05.高氧组和对照组细胞SENP1 蛋白相对表达量分别为 0. 76 ± 0. 12、0. 67 ±0. 02,乙酰化 p53 蛋白相对表达量分别为 0. 81 ±0. 07、0. 52 ± 0. 03,两组比较,P 均 < 0. 05.

  3 讨论。

  近年来,早产儿的出生率逐年增高,早产儿中大部分会发生夭折,氧疗是提高早产儿存活率的有效方法,但是长时间高浓度吸氧可导致肺损伤,从而导致 BPD 的发生[7].活性氧簇( ROS) 增多所致的氧化应激损伤是早产儿高氧肺损伤发生的主要机制[8],而 SIRT1 蛋白能显着降低 ROS 水平和促进细胞生存[9].

  SIRT1 蛋白是一种 NAD+依赖性脱乙酰酶,作为哺乳动物生命周期相关蛋白,其主要功能是调节细胞氧化应激反应和调控生命周期。SIRT1 蛋白主要定位于细胞核,在细胞能量代谢、DNA 损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、抗氧化逆境和延长细胞寿命方面发挥重要的调控作用,是机体内抗氧化应激的关键蛋白[10,11].Yang 等[12]用紫外线辐射、过氧化氢诱导人肺腺癌细胞后发现,SIRT1 蛋白可发生翻译后修饰,在 734 位赖氨酸上发生小泛素样修饰蛋白( SUMO) 修饰。该修饰决定着 SIRT1 蛋白在细胞核的定位。这是一个动态的、可逆的过程,其去 SUMO 修饰的过程则由 SENP1 介导[13,14].SIRT1蛋白主要存在于细胞核,少量存在于细胞质,当细胞应激时 SIRT1 蛋白能被 SENP1 去 SUMO 化,使 p53蛋白的第 382 位赖氨酸残基去乙酰化减少,抑制p53 与靶 DNA 顺式原件结合,进而抑制 p53 促凋亡活性[15 ~18].本研究显示,高氧组细胞生长较差,细胞间隙增宽,悬浮细胞较多,细胞的凋亡率增加,这与我们的前期实验[6]结果一致,即高氧可以诱导细胞凋亡。本研究还显示,高氧组 SENP1 蛋白表达、SIRT1 转位率、乙酰化 p53 表达均较对照组升高,这与 Yang 等[12]结果一致。提示高氧可诱导细胞凋亡,其凋亡的机制与 SIRT1 蛋白相关。

  总之,高氧诱导 SENP1 蛋白表达,促使 SIRT1蛋白发生去 SUMO 化,发生核质转位,去乙酰化活性减低,对 p53 去乙酰化活性减低,乙酰化 p53 相对增加,从而激活下游的凋亡通路而介导细胞凋亡。

  参考文献:

  [1]Hilgendorff A,Reiss I,Ehrhardt H,et al. Chronic lung disease inthe preterm infant. Lessons learned from animal models[J]. Am JRespir Cell Mol Biol,2014,50( 2) : 233-245.

  [2]Jin L,Yang H,Fu J,et al. Association between oxidative DNAdamage and the expression of 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 inlung epithelial cells of neonatal rats exposed to hyperoxia[J]. MolMed Rep,2015,11( 6) : 4079-4086.

  [3]Schumacker PT. Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactiveoxygen species signaling in triggering res-ponses[J]. Proc AmThorac Soc,2011,8( 6) : 477-484.

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