畜牧兽医论文
副结核病是由副结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性传染病，该病对奶牛业和肉牛业发达的国家造成巨大损失。目前尚无有效的治疗方法，只能及时检出，隔离，淘汰病畜。依据 IS900 为副结核特有的插入序列，其拷贝数高达 20 这一特点，以其副结核 C-2株染色体脱氧核糖核酸（DNA）为模板，设计特异性引物，建立 IS900 基因的 PCR 扩增。将扩增产物进行凝胶电泳，在电泳图上，出现与目的基因等长的 DNA带。这种方法对于快速准确的确诊副结核病，具有重要的意义。
1、 病原
副结核分枝杆菌又称禽分枝杆菌副结核亚种，是引起副结核病的病原。副结核分枝杆菌主要感染牛羊等反刍动物，在原生动物负鼠，野兔，野生猫，野猪，赤鹿，野牛等动物体内也可分离出该菌，甚至在食肉鸟类，灵长类动物及人体中也发现其存在。被感染的动物表现为顽固性腹泻，呈间歇性或周期性，严重者粪便如水样，喷射状排出或稀粥样，恶臭，含有蛋白凝块，气泡和大量粘液。随着腹泻症状的延续，病畜出现贫血，进行性消瘦。许多牛在发病后，高度渴感而大量饮水，下颌间隙和胸部等处出现不同程度的浮肿，肿胀面积大小不一。剖检发现，小肠末端出现广泛的肉芽肿。取病料后镜检观察，发现革兰氏阳性的短杆菌，抗酸性染色阳性，为红色成丛或成堆的两端钝圆的中小杆菌。副结核病的潜伏期长，病程缓慢，虽然年发病率仅为 1%~2%，但感染率极高。
2、 PCR 的原理
PCR 技术是 20 世纪 80 年代中期发展起来，又称聚合酶链式反应，是体外扩增 DNA 的途径之一。他主要通过选择目的基因后，设计特异性的引物，在DNA 聚合酶，脱氧核苷三磷酸（dNTP）的作用下“变性 - 退火 - 延伸”循环若干次，继而达到在几小时内将目的基因扩增到几十万倍甚至几百万倍的目的。
变性，即将模板 DNA 加热至 93℃左右后，模板 DNA的双螺旋结构打开，成为单链，为与引物结合做好准备。退火，即模板 DNA 变成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板单链的互补序列配对结合，然后 DNA模板 - 引物结合物在 DNA 聚合酶的作用下以寡核苷酸为反应原料，以靶序列为模板，按碱基互补配对和半保留复制原理合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。
副结核分枝杆菌有 19 个不同的插入序列，每个插入序列有其独特的拷贝数。IS900 一般为 14~20 个拷贝，其长度为 1451 bp （注：bp 表示碱基数量），G+C 含量为 66%，IS1311 有 7 个拷贝，ISMav2 有 3个拷贝，f57 有一个拷贝，Locus255 有一个拷贝。本文将扩增副结核的插入序列 IS900 基因的片段。
3、 实验材料及方法
菌株为副结核分枝杆菌 C-2 株。试剂包括dNTP、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker（DL2000）、琼脂糖、TE、溴化乙锭、溴酚蓝。仪器与设备包括 PCR 仪、电泳槽、微波炉、微型离心机、移液器、电子天平。PCR 引物的设计：以副结核特有的 IS900 序列（GeneBank Accession No.为 S74401）为模板设计特异性引物，P1：5'CGGCACGGCTCTTGTTGT3'；P2：5' TG-GTCGTCTGCTGGGTTGA3'。两引物的间距为 577bp。
PCR 扩增的反应条件。在离心管中加入下列扩增反应液：菌体 DNA 模板 1.5 微升，上下游引物各0.5 微升，TaqDNA 聚合酶 0.5 微升，10×buffer 2.5 微升，dNTP2 微升，加灭菌水 17.5 微升，反应总体积为25 微升。瞬时离心，把管壁上的液体甩下去。将离心管放入 PCR 仪中。98℃预变性 8 分钟后，按下列温度进行 30 个循环：99℃变性 1 分钟，55℃复性 1 分钟，72℃延伸 1 分钟。
用电子天平称取 1 克琼脂糖倒入锥形瓶中，加入 100 毫升 TE，配成浓度为 1%的琼脂糖凝胶溶液。再向溶液中加入 6~7 微升的溴化乙锭。稍凉后，倒入琼脂糖凝胶板中，待其凝固后备用。琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物进行浓度为 1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将琼脂板放在紫外投影仪下观察，记录实验结果。
4、 结果与讨论
在电泳图谱上可见两条很亮的 DNA 带位于约分子质量标记中 500~750bp 之间，由于设计的两个引物之间的间距为 577bp，由此可以看出已经成功的扩增出 IS900 的基因片段。（见图 1）本次实验通过聚合酶链式反应，再结合琼脂糖凝胶电泳检测，成功的扩增了副结核分枝杆菌的插入序列一IS900基因片段，得到与目的基因大小相同的DNA带，使体外扩增特异性基因成为可能。这可以做为副结核病诊断的现实基础，为快速准确的检出副结核病畜及未发病的带菌畜提供依据。随着牛奶检测要求和进口牛数日益增加，副结核病的检测日益受到人们的关注。最新研究的PCR一限制性内切酶技术和荧光PCR的出现，对于清除和预防副结核病，保护人们的身体健康，促进畜牧业快速健康发展，具有重要的指导意义。