6株益生菌对AFB1的吸附脱毒能力

　　黄曲霉毒素（ AF） 主要是由黄曲霉和寄生曲霉等多种真菌产生的具有极强致癌、致崎和致突变性的次级代谢产物，是一类结构和理化性质相类似的化合物。已发现 AF 有 B1、B2、G1、G2、M1和 M2等 10 多种衍生物，其中黄曲霉毒素 B1（ AFB1） 毒性最强，污染范围最广，其急性毒性是氰化钾的 10倍，砒霜的 68 倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的 75 倍，被世界卫生组织国际癌症研究机构（ LARC） 列为 1 类致癌物质（ Joe 等，1998） .AF 污染饲料及其原料不仅会导致畜禽生产性能下降、患病甚至死亡，同时还可导致畜产品及其加工制品中残留的毒素和其代谢产物，通过食物链威胁人类健康。人类 AF 急性中毒表现为急性肝炎，慢性中毒将引发肝细胞发生癌变，调查显示，肝癌高发区地理分布与该地区食物被 AFB1污染程度呈正相关，中国肝癌高发区广西扶绥县居民膳食原料样中 AFB1阳性率为 48. 8%,超标率为 27. 1% （ 计成，2012） .有效控制和解决 AFB1对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全具有重要意义。

　　动物生产中应用较为广泛的脱毒方法是通过添加硅铝酸盐和酵母细胞壁提取物等吸附剂对被污染饲料进行脱毒处理，但存在降低饲料营养价值，安全性受到质疑等为题。目前，安全、绿色及无污染的益生菌制剂吸附及降解霉菌毒素成为研究热点。

　　El - Nezami（ 1998） 等筛选出对 AFB1具有较强吸附能力的鼠李糖乳杆菌 GG 和 LC - 705,李志刚等（ 2003） 也筛选出能吸附氯化钠注射液中 AFB1的乳酸菌。试验从传统食材中筛选出 6 株益生菌，选取市售酵母细胞壁提取物及硅藻土膨胀颗粒脱毒剂，采用 ELISA 法分别检测其对 AFB1的吸附脱毒能力，为实际应用提供技术支持。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　1.1.1 仪器与试剂

　　SK - 1 快速混匀器； DG5033A 酶标仪； HZQ -F160 震荡培养箱； PB - 10 电子分析天平。

　　AFB1标准品（ Fermentek 公司） ; AFB1检测试剂盒（ 北京华安麦科生物技术有限公司） ; YPD 培养基； MRS 培养基； PBS 工作液。
　　
　　1.1.2 益生菌菌体的获得

　　酵母菌： 从地方传统发酵面粉中分离获得 3 株菌株，编号为 J1、J2 和 J3.分别接种于 YPD 液体培养基，30 ℃，180 r/min 振荡培养36 h,5 000 r/min离心 10 min,弃去上清液。菌体悬浮于 pH 6. 0 的PBS 液中 100 ℃ 加热 30 min, 离心， 收集菌体，干燥。

　　乳酸菌： 从传统食材中分离获得 3 株菌株，编号为 R1、R2 和 R3.分别接种于 MRS 液体培养基，37 ℃ ,180 r / min 振荡培养 24 h,5 000 r / min 离心10 min ,弃去上清液。菌体悬浮于 pH 6. 0 的 PBS液中 100 ℃加热 30 min,离心，收集菌体，干燥。【1】

　　
　　1.2 试验方法

　　1.2.1 AFB1标准溶液吸附试验

　　在分别装有 10 mg 上述干燥菌体、酵母细胞壁提取物和硅藻土膨胀颗粒的离心管中加入 0. 5 mL质量浓度为 1 000 ng/mL 的 AFB1标准溶液，用己调好 pH 6. 0 的 PBS 缓冲液定容至 10 mL,使溶液AFB1初始质量浓度为 50 ng/mL,吸附剂质量浓度为 1 mg/mL.对照组是不添加任何毒素吸附剂质量浓度为 50 ng/mL 的 AFB1标准溶液 10 mL.离心管置于 37 ℃，180 r/min的恒温震荡培养箱中振荡孵育 2 h.菌悬液 5 000 r/min 离心 10 min,收集上清液，ELISA 法检测 AFB1含量。

　　1.2.2 霉变葵头粉吸附试验

　　取霉变葵头粉样品，过 40 目分析筛，取筛上物为试验样品。称取 3 份 20 g 样品分别与 0. 2 g 酵母菌 J1、酵母细胞壁提取物和硅藻土膨胀颗粒均匀混合（ 吸附剂质量浓度为 10 g/kg） ,对照组 15 g 样品中不添加任何吸附剂，37 ℃恒温吸附 90 min,过筛，取筛上物检测 AFB1含量。

　　1.3 数据处理

　　1中 AFB1含量。按如下公式计算吸附量 Q/（ ug/g） 和吸附率 Y/%:Q = V × （ C0- C） / mY = （ X1- X2） /X1× 100%式中 V 为溶液体积/mL,m 为吸附剂用量/mg,C0和 C 分别为反应前后霉菌毒素质量浓度/（ ng/mL） ,X1和 X2分别为对照组和处理组 AFB1质量浓度/（ ng/mL） ,Y 为吸附率/%.

　　2 结果与分析

　　2.1 不同吸附剂对 AFB1标准溶液体外吸附效果的影响

　　从表 2 可见： 实验室分离的 6 株益生菌中，3株酵母菌和 1 株乳酸菌对 AFB1有一定吸附作用，吸附率介于 4. 67% ~ 33. 33%,其中 3 株酵母菌吸附率（ 33. 33%、9. 52%和 9. 52%） 均高于乳酸菌吸附率。3 株酵母菌对 AFB1的吸附能力也有差别，这与刘畅等（ 2010） 研究酵母菌和 Hernandez - Mendoza等（ 2009） 研究乳酸菌对 AFB1吸附作用结果相一致。

　　与市场购置的 2 种吸附剂比较，4 株益生菌对 AFB1的吸附率低于酵母细胞壁提取物和硅藻土膨胀颗粒的吸附率。【2】

　　
　　2.2 不同吸附剂对霉变葵头粉中 AFB1体外吸附效果的影响

　　选择对 AFB1标准溶液吸附效果最好的酵母菌J1,研究比较与市场购置的酵母细胞壁提取物和硅藻土膨胀颗粒对霉变葵头粉中 AFB1的吸附效果。

　　结果表明，硅藻土膨胀颗粒吸附能力最强，吸附率为 29. 68%,酵母菌 J1 吸附率（ 25. 93%） 介于硅藻土膨胀颗粒和酵母细胞壁提取物间（ 见表 3） .【3】

　　
　　3 讨论

　　影响霉菌毒素吸附剂吸附效果的因素很多，如吸附剂晶体结构和物理特性，霉菌毒素分子结构及其理化特性，饲料霉变程度，吸附剂添加量，试验方法及霉菌毒素检测方法等。研究结果表明，实验室分离的 6 株益生菌中 4 株对 AFB1有一定吸附作用，吸附效率存在差异，与市场购置的 2 种吸附剂比较也存在差异。
　　
　　3.1 酵母菌吸附 AFB1的机制

　　酵母细胞壁上的糖类（ 甘露糖） 是吸附毒素的主要成分，葡甘露聚糖是从酵母细胞壁中提取出来具有孔状结构的功能性糖类，具有吸附毒素的作用（ Shetty 等，2007） .依 据 刘 畅 （ 2010） ,Shetty 等（ 2007） 研究结果，试验对益生菌株采取 100 ℃，30 min热灭活处理，热处理后的益生菌细胞壁增厚，细胞表面凹凸不平，明显增大与 AFB1接触面积。

　　这可能是由于加热使细胞壁结构变得疏松，通透性增大，致使细胞表面一些隐藏吸附位点暴露，从而提高对 AFB1的吸附能力。

　　3.2 乳酸菌吸附 AFB1的机理

　　Haskard 等（ 2001） 采用间接竞争 ELISA 方法研究证实结合 AFB1是乳酸菌细胞表面的糖类和或蛋白质起重要作用。El - Nezami 等（ 1998） 对乳酸菌进行热灭活处理和酸灭活处理，试验结果表明灭活菌提高其对 AFB1的清除能力。灭活菌可吸附 AFB1说明乳酸菌结合 AFB1也是发生在细胞壁上。

　　4 结论

　　研究结果表明，实验室筛选的 3 株酵母菌和 1株乳酸菌具有吸附 AFB1的能力，吸附率介于4. 76% ~ 33. 33% ,不同酵母菌和乳酸菌对 AFB1的吸附能力不同。

　　筛选出的 1 株酵母菌可一定程度清除霉变葵头粉中 AFB1,其吸附脱毒效果介于试验所选的吸附剂酵母细胞壁提取物和硅藻土膨胀颗粒间。

　　微生物可物理吸附清除霉菌毒素，也可利用微生物代谢产生的酶生物降解霉菌毒素。计成等（ 2012） 研究在最佳发酵条件下黏球菌对 AFB1的降解率达到 80. 7%,推测其作用机制与 AFB1中氧杂蔡邻酮环的芳香内醋和甲氧基发生改变有关。目前，关于霉菌毒素解毒机制及解毒酶特性因涉及毒理学、代谢动力学及生物化学等多学科知识，且受微生物生物酶分离纯化过程复杂、酶活不稳定及作用条件苛刻等因素影响，一定程度上制约了霉菌毒素生物降解的研究进展，限制了其在实际生产中的应用研究。因此，应用现代分子生物学方法及基因工程表达高效解毒酶基因，规模化生产高效及安全霉菌毒素降解酶是今后研究方向。酵母菌和乳酸菌自身的益生作用，使其在未来开发酶制剂和新型饲料方面有一定的应用前景。