枯草芽孢杆菌表达系统及抗菌肽的表达综述(2)

　　2 抗菌肽在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达

　　如上所述枯草芽孢杆菌表达系统目前还不是很完善。 但是其对于饲用抗菌制剂的开发具有独特的优点，加上近几年这个系统的逐渐成熟，人们逐渐将抗菌肽的表达转移到枯草芽孢杆菌上来。

　　目前，大约有 2300 多种抗菌肽被发现，不同的抗菌肽具有不同的抑菌谱。 对于枯草芽孢杆菌表达系统来讲， 那些对革兰氏阴性菌有高杀伤力而对革兰氏阳性菌没有杀伤力的抗菌肽可以采用直接表达的方法； 而对于大部分既能杀灭革兰氏阴性菌又对革兰氏阳性菌有杀伤力的抗菌肽必须采用融合表达的策略。

　　2.1 直接表达 在畜牧业生产中，很多致病菌是革兰氏阴性菌，如常见的鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和引发仔猪白痢的大肠杆菌等。 因此部分对革兰氏阴性菌有高杀伤力而对革兰氏阳性菌没有杀伤力的抗菌肽在畜牧业生产中具有重要意义。 李丽等（2009）利用抗菌肽 Abaecin 对革兰氏阴性菌有很强的杀伤力， 而对革兰氏阳性菌没有杀伤力这一特点选择了枯草芽孢杆菌作为表达宿主菌。 利用重叠 PCR 获得了 Abaecin 的基因序列AP,将 AP、质粒 pHCMC05 的启动子 Pspac 及阻遏蛋白基因 LacI 和质粒 pAX01 的终止子 t0t1 插入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒 pGJ103 中构建了新型表达质粒 pGplat, 并利用麦芽糖诱导表达抗菌肽 Abaecin. 在枯草芽孢杆菌的发酵液中检测到了抗菌肽 Abaecin, 其生物活性得到也验证。 岳敏杰（2013）利用枯草芽孢杆菌表达质粒pWB980 为骨架构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒 pWBAO, 在枯草芽孢杆菌中表达了鸡干扰素 ChlFN-a,利用蔗糖进行诱导表达，但是产量较低。虽然通过直接表达可以获得一些抗菌肽，但是大部分抗菌肽具有广谱的抗菌性， 想要得到必须通过融合表达的方法获得。

　　2.2 融合表达 广谱的抗菌肽在枯草芽孢杆菌。系统中表达面临 2 个难题： 抗菌肽的抗菌特性使其对宿主菌具有潜在的致命毒性； 抗菌肽小分子量和高阳离子性使其易被蛋白水解酶降解。 而采用融合表达可以克服这两个难题。 Chen 等（2009）利用 SUMO 融合技术首先在枯草芽孢杆菌中表达出了广谱性的抗菌肽 Cecropin AD, 将 SUMO融合蛋白和 SUMO 切割酶构建到同一个质粒载体中， 从而实现将广谱性抗菌肽 Cecropin AD 直接表达到发酵液中。 陈香等 （2011） 和王阿荣等（2011）将利用此种方法表达的抗菌肽直接添加到了仔猪的日粮中， 结果表明这种抗菌肽制剂可显着改善饲料转化率，降低饲料成本，提高断奶仔猪的生产性能和机体免疫性能。 但是用这种方法获得抗菌肽的产量偏低， 不能达到工业化生产的水平。 栾超（2014）比较了 3 种融合技术（Trx、Gst 和SUMO）对抗菌肽 CBF 表达量的影响，证实 SUMO融合技术效果最好。为了提高产量，其在枯草芽孢杆菌系统中分别表达 SUMO 融合蛋白和 SUMO切割酶，但是其过程因多了一步体外切割，故较繁琐。 为了简化表达纯化抗 菌肽的过程 ,He 等（2015）利用内含肽自切割技术首次在枯草芽孢杆菌中表达出了抗菌肽 CBF, 并且纯化过程只需一步，较为简单，但是产量很低，离工业化生产的目标相距较远。 谢海伟等（2011）和尚田田（2014）均在枯草芽孢杆菌中表达获得抗菌肽。 近年来，利用枯草芽孢杆菌表达的抗菌肽所采用的方法、融合系统和产量等指标见表 1.

　　3 小结

　　目前， 随着枯草芽孢杆菌基因工程不断的发展完善， 越来越多的与工业发酵相关的基因获得成功表达。 但是相对于大肠杆菌表达系统其还有很多需要改进的地方，如构建更小、拷贝数高的新型质粒载体；进一步提高质粒的稳定性与安全性；遗传操作方法需要进一步优化， 尤其要解决枯草芽孢杆菌转化效率偏低的问题； 筛选更强的启动子。 可以预见，随着这些问题的解决，枯草芽孢杆菌将具有更为广阔的应用前景。

　　参考文献

　　[1] 陈香，谯仕彦，李波，等。添加天蚕素抗菌肽对断奶仔猪生长性能的影响[J].中国饲料，2011,12:30.

　　[2] 单安山，马得莹，冯兴军，等。抗菌肽的功能，研发与应用[J].中国农业科学，2012,45（11）：2249 ~ 2259.

　　[3] 李丽，谯仕彦，祝发明，等。蜜蜂抗菌肽 Abaecin 在枯草杆菌中的分泌表达[J].畜牧兽医学报，2009,40（11）：1681 ~ 1685.

　　[4] 李瑞芳，张添元，罗进贤。双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定[J].微生物学报，2006,46（5）：714 ~ 719.

　　[5] 栾超。利用 SUMO 融合技术在枯萆芽孢杆菌中重组表达抗菌肽 catheli-cidin-BF 及其生物学活性研究：[博士学位论文][D].杭州：浙江大学，2014.

　　[6] 尚田田。枯草芽孢杆菌表达体系高效表达抗菌肽 PNK-19 方法的建立：[硕士学位论文][D].新乡：河南科技学院，2014.