畜牧兽医论文
近年来，山东省水貂养殖业蓬勃发展，水貂年产量居全国第一[1]. 然而疾病的发生给水貂养殖带来巨大威胁，其中大肠杆菌病是水貂常见疾病之一。 水貂大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的一种急性肠道传染病，多发生于 40 ~ 60 日龄幼貂，常呈败血型经过，并伴有严重下痢。 若治疗不及时或不当，会导致动物大量死亡[2 -3]. 临床上主要是使用抗菌药物控制大肠杆菌病的发生，随着药物使用或滥用，大肠杆菌的耐药性增强，而且出现多重耐药菌株[4]. 已有的水貂源大肠杆菌药敏检测发现，菌株对环丙沙星、诺氟沙星、链霉素、四环素、氨苄西林等 5 种药物耐药率均大于50%[5 -7]. 由于各养殖场的用药情况不尽相同，水貂源大肠杆菌对粘杆菌素、大观霉素等药物耐药率、耐药谱型是否增高和扩大，这有待检测。 因此，本实验从山东省胶东地区部分养貂场采集水貂粪样，按细菌常规分离、鉴定方法，获得 8 株大肠杆菌。 采用 K - B 纸片扩散法进行了菌株对 9 种抗菌药物的药物敏感性试验，旨在指导兽医临床合理使用药物，也为大肠杆菌耐药机制研究提供材料。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 样本
2015 年 3 月在山东胶东地区某水貂养殖场无菌采集水貂粪便。 质控菌： 大肠杆菌 ATCC25922 由西南民族大学兽医药理学实验室保存并提供。
1. 1. 2 主要试剂及培养基
肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（ 15* 10） 、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、LB 肉汤、MH 肉汤培养基，MH 琼脂培养基购自杭州微生物试剂有限公司。
1. 1. 3 药敏纸片
大观霉素（ Spt,25μg/片） 、妥布霉素（ Tob,30μg/片） 、阿米卡星 （ Ami,30μg/片） 、粘杆菌素 （ Pmb,25μg / 片） 、萘啶酸 （ Nal,30μg / 片） 、环丙沙星 （ Cip,10μg / 片） 、恩诺沙星 （ Enr,5μg / 片） 、沙拉沙星 （ Sar,5μg / 片） 、左氟沙星（ Lev,5μg / 片） ,共 9 种药敏纸片使用原料药购自中国兽药监察所或由成都中牧公司提供。 药敏片按照标准制作方法制作。
1. 2 方法
1. 2. 1 大肠杆菌的分离、纯化
蘸取少量的新鲜粪便划线接种于麦康凯琼脂培养基，37℃培养 24h 后观察菌落的生长情况。 选取典型的玫瑰红色、湿润、边缘整齐、大小适中菌落接种于麦康凯培养基和伊红美兰培养基上，37℃培养 24h 后挑取典型的单菌落进行纯培养[8 -11].
1. 2. 2 鉴定和保存
将分离纯化的可疑菌株采用革兰氏染色和生化检验进行鉴定。革兰氏染色及镜检： 菌株经涂片干燥固定，经初染、媒染、脱水与复染后镜检。
生化鉴定： 将生长特性及革兰氏染色符合大肠杆菌特征的菌株，接种于葡萄糖等肠杆菌科细菌生化编码鉴定管进行鉴定。 经以上方法鉴定为大肠杆菌菌株增菌后，甘油菌于 -20℃保存备用。
1. 2. 2 药敏试验
药敏试验采用“K - B 纸片扩散法”[12]. 用灭菌棉拭子蘸取纯大肠杆菌菌液，均匀涂抹于 MH 琼脂培养基，反复几次，每次将平板旋转 60 度，最后沿平板周围涂一圈，以保证菌液涂布均匀。 用镊子夹取药敏纸片贴在琼脂表面，并用镊子轻压固定，放入 37℃恒温箱中培养，24 小时后，量取抑菌圈直径。 药敏结果按照 CLSL 标准进行判断[13].