畜牧兽医论文
2.2 兔成纤维细胞转染
提前 24 小时将成纤维细胞以 5×105个·mL-1密度铺匀至 6 孔板，至转染时细胞生长液至 60%.转染前 1 小时换成无抗性的 DMEM.配置转染工作液：A:将 2 μL vigofect 用生理盐水稀释至 100 μL,静置10 min.B:取 5 μg DNA（Cas9、gRNA、EGFP-N1）稀释至 100 μL,静置 10 min.将 A 工作液逐滴加入 B 工作液中，静置 15 min.将 AB 工作液逐滴加入成纤维细胞中。待 48 小时用高内涵显微镜计算转染效率。
2.3 目的片段扩增
按照基因组提取试剂盒步骤提基因组，-20 ℃保存。根据标准兔子 Myostatin 基因打靶位点，利用primer 5 设计引物，F:ATCCCTTTTTAGAGGTCAAGGTA,R:TTGTGTTTAAGTGACTATAGCAT.预计产物大小为 502 bp.如果打靶成功，在 136 bp 左右会有碱基突变。引物均由北京生物工程公司合成。25 μLPCR 体系：10× Buffer:2.5 μL,NTP:2.5 μL,引物各0.8 μL, 模板 100 ng,dream taq 0.25 μL 补 水 至25 μL.Pcr 反应条件是：95 ℃，3 min,95 ℃ ,30 s,55 ℃，30 s,72 ℃，60 s,进行 35 个循环，最后在 72 ℃延伸 10 min.取扩增产物 2 μL,1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2.4 T7 Endonuclease1 酶切鉴定
取野生型（wild type）PCR 产物 200 ng,实验组PCR 产物 200 ng 混匀。NEB buffer:2 μL,用 endo-free water 补至 20 μL 体系，温度梯度降温：95 ℃，5 min;85 ℃，1 min;75 ℃，1 min;65 ℃，1 min,55 ℃，1 min,45 ℃ ,1 min;35 ℃ ,1 min,25 ℃ ,1min;4 ℃ ,1 min.1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3 结果
3.1 转染效率
将 Cas 9 与 gRNA 按照摩尔数 1∶2、1∶1 转染成纤维细胞，利用 EGFP-N1 质粒所含有的荧光鉴定转染效率，利用高内涵显微镜分析转染结果为 8%（图 2）。
3.2 目的片段扩增
提取细胞基因组进行扩增目的片段为 502 bp,与预期大小一致，（图 3）
3.3 T7 Endonuclease1 酶切鉴定结果
T7 Endonuclease1 酶切加过在 366 bp 处有碱基突变，Cas 9 与 gRNA 摩尔数之比为 1∶1 和 1∶2 时，都能成功发挥基因修饰作用，将目的基因突变。
4 讨论
CRISPR/Cas9 技术作为一种新型的基因修饰工具，不仅可以对单一打靶位点修饰，也可以同时对多种基因进行同时修饰，获得转基因动物。根据CRISPR/Cas9 技术产生转基因的胚胎干细胞或者转基因动物，作为疾病治疗以及在全基因组关联研究（genome wide association studies,GWAS）上扮演着重要角色。并且原理简单，设计方便，价格便宜，在生物技术以及医药等方面有很大的积极作用。但是近年来，又有相应文献提出 CRISPR/Cas9 的打靶效率非常低，可能是由于脱靶问题的产生，影响脱靶效率。
利用 CRISPR/Cas9 技术控制基因的表达，可以试着和寡核苷酸文库的全基因组层面上扫描或者与编辑和干扰单个基因的功能相结合。这些技术仍然是有选择性的，并且需要较好的理解他们在分子水平上的应用。根据国外经济学家预测，若干年后，转基因动物生产的药品将逐步发展成为能够产生巨大社会效益和经济利益的产业，转基因动物生物反应器产业将成为最具高额利润的新型工业。CRISPR/Cas9 技术是在 TALEN 和 ZFN 之后新兴的一种基因修饰技术，其设计的复杂程度要比 TALEN 简单了许多[9],而且打靶效率也有显着差异（敲入克隆效率高出近10倍）。实验利用 CRISPR/Cas9 技术成功打掉兔成纤维细胞上的 myostatin 基因，证明了 CRISPR/Cas9 系统在细胞水平上可以成功敲除目的基因，为下一步研究 myostatin 基因缺失型的兔子打下基础。
参考文献：
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