畜牧兽医论文
猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleurop-neumonia,PCP） 是一种由胸膜肺炎放线杆菌（Acti-nobacillus pleuropneumoniae,APP））引起的高度接触性呼吸道疾病，又称猪接触性传染性胸膜肺炎。自1957 年，Pattison 首次报道以来，世界各地相继报道了本病，猪传染性胸膜肺炎己经成为威胁养殖业健康发展的严重疾病，广泛分布于世界各地[1].近年来猪传染性胸膜肺炎发病和流行呈逐年上升的趋势，猪感染本病后常出现急性和慢性感染，急性猪传染性胸膜肺炎以急性出血性胸膜肺炎为特征，病猪发热（可达 42 ℃）、呼吸困难、食欲不振，呈现高死亡率；慢性感染后以纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征，潜伏于猪群内，可使患病猪生长缓慢，饲养报酬降低。
常与猪瘟、蓝耳病及链球菌等其他疾病混合感染[2],导致猪群的高发病率和高死亡率，危害极其严重，使控制难度加大，已被国际公认为现代养猪业的重要疫病之一。自 1987 年我国黑龙江地区首次报道以来[3],山东、河南、北京等地区均相继报导该病发生，且血清型之间存在差异，目前仍在部分地区流行和蔓延，对我国养殖业发展造成重大的损失。
猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）属于放线菌属，革兰氏染色阴性，两极着色，有荚膜，无芽孢，无运动性。主要包括生物Ⅰ型（NAD 依赖型）毒力较强，生物Ⅱ型（非 NAD 依赖型），毒力较弱。根据细菌荚膜多糖和脂多糖的不同，生物Ⅰ型分为 12 个血清型，生物Ⅱ型有 2 个血清型（13、14），其中血清 5 型进一步分为 5A 和 5B 两个亚型。我国流行的主要以生物Ⅰ型中的血清 7 型为主，其次为血清 1、2、4、5、10 型，其余血清型主要分布于欧洲等地区[4].由于 APP 的血清型众多，且各个血清型间的交叉保护性不强，给生产过程中的预防工作带来极大的困难；免疫接种是预防本病的主要途径，但由于其免疫机制尚不明确，至今国内外仍缺乏理想的疫苗。因此，实验采用人工感染各种常用实验动物的方法，模拟病原菌的感染条件[5],建立本病的小鼠动物模型，为今后的疫苗研发和揭示该病的发病机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株和实验动物
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 7 型菌株，为从大庆市周边猪场中发病猪体内分离得到，并通过细菌生化试验和血清学试验鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌7 型，保存于黑龙江八一农垦大学预防兽医学实验室，猪胸膜肺炎标准阳性血清由哈尔滨兽医研究所惠赠；实验用 5 周龄 SPF 级昆明小鼠（KM 小鼠），体重 20~28 g,购于北京维通利华实验动物有限公司；SPF 级大鼠，体重 280 g 左右，清洁级豚鼠，体重 250 g左右，清洁级兔子，体重 1.3 kg 左右，购于哈尔滨医科大学实验动物中心。
1.1.2 主要试剂
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）液体培养基，胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）固体培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；NAD 生长因子购自 amresco 公司；2 000 bp maker 购自 takara 公司；琼脂糖购自 Biow-est 公司，磷酸盐缓冲液（PBS）自配。
1.1.3 PCR 引物设计
根据 GenBank 中的基因序列，并参照文献采用Oligo 7 软件设计了 1 对引物[6],由哈尔滨博仕生物有限公司合成，上游引物 APP-1:GGGGACGTAACTCGGTGATT,下游引物 APP-2:GCTCACCAACGTTTGCTC;扩增产物片段大小为 377 bp.
1.2 实验方法
1.2.1 易感模型动物的筛选
将 App-7 菌株接种含 10% 犊牛血清和 1%NAD的 TSB 培养基中，37 ℃ 、180 r·min-1摇床培养 12 h,用无菌 PBS 将培养物配制成 1.8×107CFU、3.6 ×107CFU、7.2×107CFU 和 1.44×108CFU 等不同剂量，参照王姝优等报道的方法[7],通过腹腔注射感染不同品种的各组模型动物，实验组每组 8 只，对照组 4只，对照组腹腔注射等量的无菌生理盐水；观察各组动物的临床症状和死亡规律，筛选出最易感的模型动物。
1.2.2 最佳感染途径的筛选
根据上步筛选出的最佳感染动物小鼠，以 1.8×107、3.6×107、7.2×107和 1.44×108CFU 四种不同剂量的菌液，通过滴鼻、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射等不同方式进行感染实验，每组均设置对照组，对照组注射等量的生理盐水，观察各组小鼠的临床表现和死亡情况，探索不同的接种方式对小鼠感染情况的差异，从而确定最适合的感染途径[8].
1.2.3 半数致死量的测定
根据之前得出小鼠全部死亡的剂量数据，用无菌 PBS 缓冲液，将 App-7 原菌液分别稀释到 1.15×108,9.21×107,7.37×107,5.9×107,4.72×107,3.77×107,3.02×107,2.41×107和 1.93×107CFU 等不同剂量接种小鼠，将小鼠随机分为 10 组，其中 1~9 组为实验组，每组 12 只，通过腹腔注射的方式注射上述不同剂量的菌液；第 10 组为对照组，6 只，注射等量的生理盐水。筛选出 App-7 对小鼠的最小致死量（Dn）和最大致死量（Dm），并根据改进的寇氏法则[9],计算出 App-7 对小鼠的半数致死量（LD50）。
1.2.4 临床剖检和细菌学检查
通过 2 倍半数致死量的菌液对 10 只 KM 小鼠进行感染实验，对照组 4 只，注射等量的无菌生理盐水；定时观察，并记录感染后 4 d 内各组小鼠的临床症状和死亡情况，并对死亡小鼠进行剖检，观察其病理变化，同时解剖对照组小鼠，与感染细菌的小鼠进行对比[10].在小鼠感染死亡后的 8 h 内，无菌采集小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等脏器，进行细菌学检查，并接种于 TSA 平板进行细菌再分离，观察菌落形态，并参照邱索平等的方法[11],对组织中分离到的细菌进行 PCR 鉴定及血清学试验。
2 结果
2.1 最佳模型动物的筛选结果
通过不同剂量组小鼠发病和死亡的结果发现，随着感染剂量的增高，小鼠的死亡数量呈现规律性的变化，且各动物所设对照组均未发病，当感染剂量为 1.8×107CFU 时，各组实验动物均未出现死亡，而随着浓度的增加，达到 3.6×107CFU 时，小鼠出现死亡 2 只，其余各组动物仍未出现死亡，进一步增加接种量，7.2×107CFU 时，有 4 只小鼠死亡，直至菌液量达到 1.44×108CFU 时，小鼠全部死亡；而 SD 大鼠在感染剂量为 3.6×107CFU 时，未出现死亡情况，当剂量达到 7.2×107CFU 时，死亡 3 只，在剂量进一步升高为 1.44×108CFU 仍死亡 3 只；死亡规律变化不明显，兔子和豚鼠在各剂量组感染实验中均未出现死亡，从而确定了小鼠为人工感染猪胸膜肺炎放线杆菌的理想模型动物。