药理学论文
虽然色谱法因众多优势成为应用最广泛的TDM分析方法，但临床上更需要能短时间处理大批样品的操作简便的方法，免疫分析法因其具备快速简便的优势在临床应用中得到了较快发展。目前，免疫分析法在TDM中的应用仅次于HPLC.其优点有：（1）检测周期短；（2）样本需求量少，且可不经过提取，自动化程度高；（3）有试剂盒，操作简单方便；（4）有合适的灵敏度、准确性、专一性和精密度。因此，采用免疫分析法进行TDM,能满足临床样品批量大和及时监测的特点，帮助临床快速分析大量样本。目前免疫分析法在免疫抑制剂、抗癫痫药、抗肿瘤药物中应用较多。
但免疫分析法也有一定的缺点：（1）只目前市场上具有检测试剂盒的药物种类有限，限制了其应用范围；（2）试剂盒价格昂贵，目前依赖进口，成本-效益低；（3）可能与原药代谢产物发生交叉反应，干扰测定；（4）需针对每一种药物研制相应的试剂盒，不适用于新药研究。故在TDM应用方面免疫分析法难以完全取代色谱分析法[24].
2.2.1放射免疫法（RIA）
RIA是最早用于TDM的免疫法，它结合了放射性示踪技术的高灵敏性，用同位素标记的抗原和未标记的抗原共同竞争抗体，通过放射性强度确定药物浓度。1虽存在放射性污染 等 缺 点，但 经 济 实 用 的 绝 对 优 势 使 其 在TDM中仍有应用。
2.2.2酶免疫法（EIA）
用酶标记抗原或抗体，利用酶高效特异性催化反应产生光度变化，从而定量检测药物浓度。酶免疫法主要包括：酶放大免疫法（EMIT）、酶联免疫吸附分析法（ELISA）、微粒子酶免疫分析法（MEIA）、克隆酶免疫分析法（CEDIA）。该法具有灵敏度高、特异性强、快捷、酶标记物稳定、有效期长、自动化、仪器及操作要求较低等优点[25],但为了保持酶的活性，试剂保存要求较高。
2.2.3化学发光免疫法（LIA）
用化学发光反应试剂标记抗原或抗体，经过抗原抗体免疫反应后测定发光强度，进而测定检测药物浓度。化学发光免疫法主要包括：化学发光免疫分析法（CLIA）、化学发光酶免疫分析法（CLEIA）、化学发光微粒子免疫法（CMIA）。CLIA同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性，由于近年来MEIA试剂先后停产，CMIA逐渐得到发展[26].
2.2.4荧光免疫法（FIA）
用荧光素标记药物分子或抗体，经过抗原抗体竞争结合反应后测定荧光偏振度或荧光信号强度，确定药物浓度。FIA主要包括：荧光偏振免疫分析法（FPIA）、时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）。FPIA方法学稳定，标准曲线有效期长，试剂稳定性好，操作快速，但所用仪器复杂、成本较高[12],存在交叉反应。TRFIA特异性和精密度与RIA法完全相同，准确度好，但仪器非常昂贵[25].
2.2.5免疫比浊法
利用抗原抗体结合后形成的复合物在特定系统中析出，形成浊度变化来测定药物浓度。免疫比浊法主要包括颗粒增强免疫透射比浊法（PETIA）、颗 粒 增 强 免 疫 散 射 比 浊 法 （PEI-NA）、颗粒增强比浊抑制免疫分析法（PETINIA）。PETIA与PEINA简单、快速、准确，易实现自动化，前者在生化分析仪上即可进行，后者需要特殊的散射比浊仪[27].
2.2.6其他
如标记抗体磁性免疫分析法（AC-MIA）、乳胶免疫抑制法、干化学测定法等。
2.3其他分析方法
色谱法和免疫法能应用于大多数药物TDM,但有许多方法由于其特有的优势，在特定药物的TDM、药动学研究中仍有应用，如光谱分析法、微透析法、高效毛细管电泳法等。
近年来，国外研究者建立了热生物传感分析法（thermal biosensing）和生物传感分析法 （biosen-sors），为β-内酰胺类抗生素等药物提供了新的分析方法。热生物传感分析法的原理为检测酶促反应产生的热量，如青霉素酶对β-内酰胺类抗生素进行酶解反应时产生的热量。该方法的优点是无需样本前处理，大幅缩短分析时间，甚至可以达到即时检测。但目前该法所能分析的底物仅限于对酶敏感的药物，限制了其应用范围，故该法仍有待进一步改进[28].
生物传感分析法在小分子物质的定量分析方法中异军突起，展现了广阔的发展前景。生物传感器由三部分组成：第一部分为生物感应器，如酶或细胞；第二部分为换能器，将信号向第三部分传导；第三部分为理化检测器，如遇到配体后荧光强度增加的物质。生物传感分析法主要用于糖尿病患者的血糖检测和微阵列法检测细菌DNA[28].
结合以上方法学进展可以预测，TDM技术还需要更多的完善和发展，进一步提高检测效率、灵敏度和精确度，并降低成本和操作要求，或将多种方法优势互补、有机结合，才能在临床上有更广泛的应用。
3 TDM交叉学科及发展方向
经过30多年的发展，TDM已形成完整的学科体系，并且在临床诊疗中扮演着重要角色。可是尽管如此，在处理方法和临床应用中TDM仍存在许多不足，不能很好地满足临床需求。例如，当血药浓度与药效之间的关系被活性代谢物、对映体、血浆蛋白结合率等影响时，血药浓度就不能正确反映药效。又如，某些药物血药浓度的个体化差异很大，临床上不能使用单一标准指导用药，而基因多态性是个体差异的主要原因。再如，即使结合了血药浓度等结果，医生凭经验设计给药方案的效果仍不够好。基于以上问题，近年来TDM在交叉学科的推动下推陈出新，游离药物及活性代谢物监测技术、药物基因组学和群体药动学受到越来越多的关注，成为新兴的发展方向。
3.1活性代谢物、游离药物、对映体监测
目前TDM方法基本上都是对血浆或血清中药物的总浓度进行监测，通过基本恒定的血浆蛋白结合率推算游离药物浓度。然而，许多因素如活性代谢物、手性药物对映体、受体对药物的反应性等均可能影响血药浓度与药效之间的关系，还有许多因素会影响血浆蛋白结合率，导致血药浓度与药效不平行。因此，测定血药浓度指导临床用药有导致治疗失败的风险，为了更加精确地提供与药效相关的血药浓度，开展活性代谢物、游离药物和对映体监测具有重要的现实意义。
当药物作为前体药物时，进入体内经代谢成为具有药理活性的代谢产物，此时只有代谢产物才能发挥药理作用，或代谢产物与原型药共同发挥药效。在这种情况下，监测代谢物的血浓度，而非原型药物浓度，才能更准确地反映药物疗效。例如，抗心律失常药普鲁卡因胺在体内代谢为活性产物乙酰普鲁卡因胺（NAPA），实际上药物的部分抗心律失常功效来自活性代谢产物，但原型药和活性产物的药动学特征有很大差异。NAPA半衰期较长，主要由肾排泄。给药两天后，肾衰竭患者体内原型药已低于有效浓度，而NAPA严重蓄积，故仍有抗心律失常作用。所以在心律失常的TDM中，普鲁卡因胺和NAPA都需要监测。又如，免疫抑制剂霉酚酸酯（MMF）在 体 内 吸 收 代 谢 为 活 性 成 分 霉 酚 酸（MPA），MPA进一步代谢为7-O-葡萄糖醛酸结合代谢物（MPAG）和酰化葡萄糖醛酸代谢物（AcM-PA）。刘晓雪等[29]建立了LC-MS/MS法来同时测定血浆中MPA及其代谢物MPAG与AcMPAG浓度，并且发现肝移植患者服药一周后MPAG明显蓄积，体内暴露量约为MPA的20倍，影响了MPA的游离分数，而只有游离的MPA才能在体内发挥药理活性。因此测定MPAG可能间接与MPA疗效相关[30],监测代谢产物MPAG对指导用药有重要意义。
药物在体内吸收后有两种存在方式：一部分与血浆蛋白结合，称为结合型药物，结合后药物暂时失活，且不易透过血管壁。另一部分游离在血液、组织、细胞内液中，称为游离型药物。当药物血浆蛋白结合率发生改变，与血浆蛋白结合的结合型药物浓度上升，与药效相关的游离药物浓度下降，此时监测药物总浓度不能作为药效指标。特别是当药物血浆蛋白结合率很高（如99%）时，游离型药物的比例很低（1%），此时血浆蛋白结合率的微小改变，对游离型药物浓度会造成巨大的影响，即使比例只有1%的增加也会使浓度加倍，极易导致药物中毒，故监测游离型药物浓度具有十分重要的临床意义。例如，丙戊酸的血浆蛋白结合率具有饱和性，当药物总浓度达稳态时，其游离型药物浓度仍有较大波动，故药物总浓度难以预测临床疗效，应监测游离药物浓度作为调整剂量的依据。
部分药物作为手性异构体，R-、S-对映体的药理活性、代谢特性和毒性通常具有显着差异。当药物只有一种对映结构具有活性时，另一种对映体的浓度会对药效指标产生干扰，因此监测消旋体血浓度不能反映药效。例如，新型抗癫痫药氨己烯酸的药理活性与毒性主要来自于S-对映体，且儿童体内S-、R-对映体血浓度比值随时间变化很大，故测定消旋体血浓度不能反映真实药效[31].目前区分对映体的检测方法发展有限。未来活性对映体监测有待进一步发展。
3.2药物基因组学
药物基因组学因其特有的前瞻能力为TDM开辟了一条崭新的发展方向。临床上，药物反应个体化差异现象非常普遍，如患者诊断、一般状况相同，给药相同且血药浓度均在治疗范围内，可是产生的疗效、毒副作用却可能完全不同。如有的患者显示给药不足，有的却出现严重的不良反应。常规TDM不能很好地解释和解决这些问题，而药物基因组学的出现为临床用药个体差异带来了更深入的解释和前瞻性的指导，向实现个体化用药和精准医疗迈出了新的步伐。
药物基因组学是从基因组水平出发，研究基因序列多态性与药物效应多样性之间相互关系的学科[32].通过研究影响药物吸收、分布、代谢、排泄等个体差异的基因特性，以及基因多态性导致的药物效应多样性，来减少不良反应的发生、提高疗效，达到个体化给药的目的[33].
只要单基因变异（即同一基因位点上多个等位基因引起的变异）发生率大于1%,则可称为遗传多态性，主要包括药物代谢酶、药物转运蛋白和药物作用靶点的多态性。随着药物基因组学的发展，人们发现基因多态性在药物敏感性、药物代谢和毒性反应中起到重要作用，因此近年来，对于个体差异大的药物，需要及时监测药物浓度及代谢情况，并结合基因检测来制定更加精准的合理化给药方案。
2010年，由于氯吡格雷个体化差异带来的严重心血管不良反应，FDA要求对氯吡格雷说明书加注“黑框警告”[34].具体内容为：警告：弱代谢者不能有效地将氯吡格雷代谢为活性产物，导致药效降低；提醒：医护人员应了解目前可以进行CYP2C19基因检测来判断患者CYP2C19的代谢能力；建议：医护人员对弱代谢者应考虑使用其他抗血小板药物或改变氯吡 格 雷 的 剂 量 方 案。氯 吡 格 雷 通 过 肝 内CYP代谢为活性产物（SR26334），能抑制血小板聚集。患者对氯吡格雷反应的个体差异表现在抑制血小板聚集率的能力上，弱代谢者接受常规治疗剂量氯吡格雷后在血小板功能试验中不能达到预期的抗血小板作用，从而使复发心血管事件的危险增加。黑框警告提醒医生，对患者在用药前进行CYP2C19基因监测，若为弱代谢者，应考虑应用其他抗血小板药物，或增加氯吡格雷的剂量。